Aislamiento de Catalasa






Aislamiento de Catalasa a partir de Staphylococcus aureus.

Altayr Gallardo Escalante, Esperanza Jiménez Montesinos, Alexandra Quiroz Sánchez, Ivet Varela Corona, Ysabel Vázquez Céspedes






RESUMEN

Se realizó el aislamiento de la enzima catalasa a partir de Staphylococcus aureus utilizando un método que involucra extracción con dioxano y posterior centrifugación de la enzima sedimentada en forma no cristalina y con actividad aparente mayor a la masa celular completa.






INTRODUCCIÓN

La importancia del desarrollo de nuevos métodos de aislamiento de esta enzima radica en el hecho de que es muy usada como reactivo en pruebas inmunológicas como ELISA y el poder obtenerla de manera sencilla es útil para disminuir el costo de realización de estas pruebas y la obtención de reactivos biológicos.

La catalasa, es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y agua. Es una hempotroteína similar en estructura a la hemoglobina, excepto que los cuatro átomos de hierro en la molécula están en la forma oxidada (Fe+++) en lugar de reducida (Fe++). La mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.1


H2O2 --------> H2O + O2

p.m.: 232000 _____ pH isoeléctrico: 5.72



La catalasa protege a los microorganismos del H2O2 tóxico que se acumula durante el metabolismo bacteriano y es liberado después de la fagocitosis.

Esta enzima y otras se encuentran ancladas en la membrana citoplasmática de la célula del Staphylococcus aureus.

Los Staphylococcus son cocos grampositivos que pueden agruparse en forma de racimos. Miden de 0.5 - 1.5 µm, inmóviles, anaerobios facultativos, catalasa positivos, que se desarrollan en medios que contienen NaCl 10% a temperaturas de 18 - 40 °C.3

La presencia de estafilococos se demuestra ampliamente usando la prueba de reacción de catalasa.4

MATERIAL Y MÉTODOS

Los medios de cultivo y material de vidrio fueron sometidos a esterilización en autoclave a 121°C, 15 lb/pul2 durante 15 minutos, dejándose a temperatura ambiente por 24 horas para la prueba de esterilidad y posterior uso.

a) Medios de cultivo

Se utilizaron 10 placas de agar 110 para estafilococos (20ml/caja), preparadas de acuerdo al método especificado en el frasco contenedor. Se prepararon además 100 ml de caldo cerebro corazón (BHI).

b) Microorganismo utilizado

Staphylococcus aureus aislados de exudado faríngeo cultivado en agar 110. Se identificaron de acuerdo a las pruebas bioquímicas específicas para este microorganismo.4

c) Cultivo in-vitro de Staphylococcus aureus.

Se hizo una inoculación de estafilococos en el caldo cerebro corazón y se incubó por 24 horas a 37°C. Posteriormente las cajas de agar 110 se sembraron masivamente utilizando como inóculo 1 ml del caldo sembrado e incubándolas por 24 horas a 37°C.

d) Fraccionamiento celular

La masa bacteriana obtenida del cultivo en cajas se recogió utilizando 1 ml de solución salina isotónica y raspado con el asa.

Esta suspensión bacteriana se depositó en un matraz erlenmeyer con perlas de vidrio y se sometió a enfriamiento a -5°C en una mezcla de hielo-acetona-sal y se agitó constantemente.

e) Extracción

Se adicionaron a la suspensión 4 ml de dioxano y se enfrió a 4°C por 24 horas. Posteriormente se realizó una centrifugación a 1500 g por 15 minutos y se separó el sobrenadante de la masa celular sedimentada.

f) Obtención de la enzima

Al sobrenadante obtenido se le agregaron 10 ml de solución saturada de sulfato de amonio y se refrigeró por 2 semanas, al cabo de las cuales se realizó una centrifugación a 1500 g por 15 minutos y decantando el sobrenadante de la nata sedimentada (enzima).

g) Cristalización

La enzima obtenida se disolvió en agua y se le adicionó sulfato de amonio (solución saturada) hasta la aparición de cristales que fueron separados por decantación.

Es importante señalar que después de cada paso se comprobó la presencia de la enzima utilizando peróxido de hidrógeno al 30% frío tanto en la masa celular (pasos b y c), sobrenadante (d, e) y sedimento (e, f), con el fin de hacer un seguimiento de la enzima durante el proceso.

RESULTADOS

Se obtuvo catalasa en forma no cristalina a partir del cultivo de 24 horas de estafilococos con actividad aparente contra peróxido de hidrógeno mayor a la masa celular intacta (aparición de burbujas).4

Cultivo de estafilococos
Cultivo de Staphyloccocus aureus
Cristales obtenidos
Cristales de catalasa obtenidos

Cabe señalar que la actividad de la enzima fue menor mientras se encontraba en solución en dioxano y solución salina.

DISCUSIÓN

La cantidad de enzima obtenida fue muy poca debido a que la masa celular utilizada fue menor a 5 g; por otra parte el proceso de aislamiento es muy lento ya que para lograr la sedimentación de la enzima de la extracción con dioxano tomó 2 semanas de refrigeración.

También se hace notar el hecho de que el método utilizado es experimental ya que no hay reportes similares del proceso y relacionados al microorganismo utilizado, ya que habitualmente se utilizan para el aislamiento de la enzima otros microorganismos y células de hígado de caballo y cerdo.2

CONCLUSIONES

El aislamiento de esta enzima por un método que utiliza pocos reactivos y con pasos sencillos es de utilidad ya que la catalasa es muy utilizada como reactivo en pruebas inmunológicas y su fácil aislamiento hace más económicas dichas pruebas.

El encontrar rutas alternativas de aislamiento por medio de la experimentación es de gran importancia para el desarrollo de métodos nuevos de separación de enzimas a partir de microorganismos de fácil cultivo y que sea más económico que la síntesis química.


BIBLIOGRAFÍA

1 Brock, T.D.; Madigan, M.T. 1991. Biology of Microorganisms. 6th edition. Prentice Hall Inc.

2 Summer, J.B.; Dounce, A.L. Crystalline Catalase. Biochemical Journal. 32: 855-861 (1938).

3 Murray, P.; Drew, W. 1996. Microbiología Médica. Editorial Mosby.

4 Konneman; Allen; Dowell; et. al. 1992. Diagnóstico Microbiológico. 3ª edición. Editorial Médica Panamericana.






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