USO DE MICROSATÉLITES EN GRAMÍNEAS PARA ESTUDIAR VARIABILIDAD: EL CASO DEL MAÍZ (Zea mays L.)

INTRODUCCIÓN

El maíz, es el tercer cereal más cultivado en el mundo, solamente detrás del trigo y el arroz, algunos autores consideran que actualmente es el segundo, por delante del arroz (Wilkes, 1993). Se puede desarrollar en una gran variedad de climas, que van desde el trópico hasta los climas templados, desde el nivel del mar hasta altitudes de 3000 msnm latitudes ecuatoriales, entre los 23° norte y 23° sur desde el ecuador (Dowswell et. Al. 1996).

El maíz es la especie cultivada más estudiada genéticamente. Hasta hace poco, esos estudios aunque contribuyeron enormemente a sentar las bases de los conocimientos actuales en biología celular, se aplicaron en forma muy limitada en el mejoramiento genético. No hace mucho se pensaba que, la posibilidad de la recombinación e intercambio de genes por ingeniería genética, hacía necesario el conocimiento del genoma, la localización de los genes en los cromosomas, la relación entre ellos y, los genes marcadores de naturaleza bioquímica (Sevilla, 1989). Hoy día ya se cuenta con variedades transgénicas y los marcadores moleculares han avanzado mucho desde el uso de isoenzimas. Uno de ellos es el de los microsatélites o secuencias simples repetitivas de ADN (Simple Sequence Repeat, SSRs).

OBJETIVO

Hacer una relación sobre la aplicación de los microsatélites como base para establecer polimorfismos en maíz y su utilidad en el estudio de la variabilidad genética.

IMPORTANCIA DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA

El decir la “variation leads, breeders follow” (la variación guía, los mejoradores la siguen) tiene mucho de verdad. El maíz exhibe una gran diversidad genética en características de planta, mazorca, semilla, resistencia a enfermedades e insectos, y tolerancia a varias presiones del ambiente (Dowswell et. Al. 1996).

El maíz es una da las plantas cultivadas de mayor interés, no sólo desde el punto de vista de su origen y estructura, sino también por su variación. Se le conoce únicamente en cultivo y seguro que sin la participación del hombre, le sería imposible subsistir. En cultivo han sido desarrollados tipos tan diferentes que permiten sembrarlos desde el ecuador hasta el límite de las tierras templadas; y desde el nivel del mar hasta el borde de las heladas permanentes (León. 1996).

Existen desde los maíces gigantes como el “Jala”, (León. 1986), del oeste de México o el “maíz de año”, en Huehuetenango, que puede alcanzar hasta 6 o 7 m de altura (Cifuentes, 1994), hasta los tipos andinos como el “San Jerónimo”, cuya talla apenas supera a las habas con que se implanta (León, 1986). En el subtrópico La diversidad de genotipos es muy alta y se basa en maíces de tipo “Flint” o duros. La variabilidad del maíz puede ser apreciada en su división de razas, que son grupos geográficos con caracteres distintos fenotípicos, de las cuales han sido descritos cerca de 250 para América Latina (León. 1999).

Fig.1. muestra de la variabilidad genética del maíz en la forma y color de los frutos.

La caracterización hasta inicios de los años 90 se circunscribía a descriptores morfológicos, a partir del uso de isoenzimas y RFLP (Restricted fragment length polimorphic) como marcadores moleculares es estudio de la variabilidad genética es factible también a nivel molecular (Sevilla, 1989). Hoy día el uso de marcadores más específicos como los AFLP (amplified fragment length polimorphism) y los microsatélites (microsatllites o Simple séquense repeat DNA marker) (Cregan y Quigley, 1997).

El genoma del maíz es de 2.5 * 10⁶ (Liu, 1997). La variabilidad genética (entendida esta como la variabilidad de los alelos que gobiernan los caracteres), es en el maíz relativamente grande. Su estudio por marcadores moleculares tiene diversas aplicaciones, como el estudio per se de la variabilidad o la selección de materiales para mejoramiento asistido por marcadores moleculares. El CIMMYT (Centro Internacional De Mejoramiento Del Maíz Y El Trigo) en sus políticas a corto y largo plazo incluye “una mejor caracterización de las accesiones ex situ incluyendo información sobre el origen, las genealogías, los caracteres y las fingerprints moleculares, que se integrarán en una base de datos electrónica mundial” (CIMMYT, 1997).

LOS MICROSATÉLITES COMO MARCADORES MOLECULARES EN MAÍZ

Las secuencias simples repetitivas (SSRs, simple sequence repeat) o microsatélites son secuencias de ADN que consisten de dos a cinco unidades esenciales de nucleótidos como AT, CTT y ATGT las cuales están arregladas en repeticiones en tándem. Estas pequeñas secuencias repetitivas de ADN, las cuales se extienden a lo largo del genoma de los eucariontes, proporcionan las bases del sistema de marcadores genéticos multialélicos y codominantes, basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las regiones a los flancos de los microsatélites son generalmente conservadas entre los genotipos de la misma especie. Los imprimadores para la PCR, correspondiente a las regiones en los flancos, son utilizados para amplificar los fragmentos que contienen los SSR de ADN. La longitud del polimorfismo es generada cuando los productos de la PCR de diferentes individuos varía en largo como resultado de la variación en el número de unidades repetidas en los SSRs (Cregan y Quigley, 1997).

Los microsatélites demostraron inicialmente, ser altamente abundantes y polimórficos en humanos y otros eucariontes, básicamente mamíferos (Hamada et al., 1982). Las longitudes de polimorfismos de alelos específicos son bien conocidas en maíz. Si bien poco es sabido sobre la función de los microsatélites dentro o cerca de los genes en las plantas, su prevalencia, alto grado de variabilidad en el número de repeticiones y su herencia mendeliana lo han convertido en un marcador muy útil en el mapeo de genoma en maíz y el resto de plantas, así como un importante marcador para los estudios de mejoramiento, especialmente la selección asistida por marcadores moleculares (Phelps y Buckner, 1995).

Los microsatélites han sido empleados para la construcción de mapas de ligamiento en varias especies incluidas el maíz (Cregan y Quigley, 1997). Se consideran los microsatélites como la segunda generación de marcadores moleculares. Los microsatélites son una fuente abundante de marcadores, debido a que ellos son altamente polimórficos y pueden ser amplificados por PCR. La secuencia resultante de microsatélites sigue una herencia simple mendeliana y ofrece la ventajas de las secuencias etiquetadas, ya que puede reproducirse su amplificación (Senior y Heun, 1993).

Para los programas de mejoramiento asistido por marcadores, es esencial que la obtención de marcadores de ADN sea fácil (Gupta et al., 1994).

Para estudiar la ocurrencia de microsatélites y su herencia en maíz, Senior y Heun, (1993), realizaron una búsqueda de más de 280 secuencias de maíz de la GenBank^®. Con base en estas secuencias se determinaron seis scuencias SSRs, las que fueron seleccionadas conforme a las secuencias flancos y con base en las cuales se diseñaron los imprimadores en dirección 5’ – 3’ y 3’ – 5’, para lograr la amplificación de los microsatélites en PCR. Posteriormente evaluaron los imprimadores en 8 líneas mejoradas de maíz y se encontraron polimorfismos para cada juego de imprimadores que cayeron en el ámbito de las expectativas de los autores, abundancia de microstélites triméricos dentro de las regiones codificantes (Senior y Heun, 1993).

Chin et al, (1996), realizaron una búsqueda de secuencias en las bases de datos GenBank y EMBL. Encotraron un total de 576 secuencias, de las cuales 200 representaron potenciales microsatélites. Las repeticiones encontradas variaron de dos a 6 nucleótidos y repeticiones imperfectas, donde las más abundantes se encontraron en aquellas repeticiones de 2 a 5 nucleótidos. Las tres más abundantes clases de microsatélites encontradas fueron las repeticiones de (AG/CT)n,(CCT/GGA)n, y (CCG/GGC)n, estas fueron probadas en 9 líneas mejoradas de maíz. De los 200 potenciales microsatélites 69 revelaron polimorfismos, donde las repeticiones de dos, tres y cuatro nucleótidos mostraron mayor número de loci polimórficos.

La evaluación de la diversidad genética del maíz se ha circunscrito en la mayoría de casos a probar diferencias genéticas entre líneas mejoradas con potencial para el desarrollo de materiales híbridos y poco se ha realizado en cuanto a evaluar la variabilidad genética de materiales silvestres o variedades indígenas de maíz. Con el uso de microsatélites, Senior y Jun (1993), en uno de los primeros trabajos en este rubro en maíz, encontraron un promedio de 3.5 SSRs polimórficos entre ocho líneas mejoradas de maíz.

La información contenida en un marcador puede ser determinada por su habilidad de diferenciar entre individuos. En un estudio de diversidad entre 12 líneas endocriadas de maíz, se encontró que la heterocigocidad de los marcadores de RFLP, en la evaluación de 96 marcadores, fue de una proporción de 0.58, comparada con microsatélites que van de 0.73 a 0.79, para secuencias diferentes de dinucleótidos (AG y AC). De acuerdo a este estudio, la información contenida en los SSRs, como medida de heterocigocidad esperada, es una función del número de alelos y la frecuencia de cada alelo en la población bajo estudio (Taramino y Tingey, 1996).

La información sobre la diversidad del germoplama y las relaciones entre materiales élite de mejoramiento, tiene un impacto significativo en el mejoramiento de plantas. Pejic et al. (1998), encontraron que diversos métodos distinguieron claramente a 33 líneas endocriadas de maíz, donde los microsatélites proveyeron del más alto nivel de discriminación entre cualquier comparación por pares de líneas endocriadas. En este trabajo se concluye que con excepción de los RAPDs (Random amplified Polimorphic DNA), Los RFLP, AFLP, Y SSR proveen información consistente para la identificación y evaluación de pedigrí de materiales de maíz. Los SSR y AFLP ofrecen mejores ventajas en virtud de su susceptibilidad a la automatización y porque la técnica de aplicación es relativamente sencilla.

Phelps y Buckner, (1995), estudiaron la longitud de polimorfismos y su asociación con la repetición de microsatélites dentro del gene Y1,el cual codifica para la enzima fitoena sintetasa, una enzima que condensa dos moléculas de geranil-geranil pirofosfato, en la molécula de la fitoena durante la biosíntesis de carotenoides en maíz. Buscaban determinar si el microsatélite CCA existen en otros alelos del gene Y1. Estudiaron la manifestación del gene y Encontraron que los polimorfismo para alelos específicos existen en la región del gene Y1. Encontraron que las secuencias para cada alelo estudiado contenían 5 y 11 repeticiones de CCA.

Se encontró que en nueve feonotipos estudiados la repetición estaba asociada al gen, pero no se determinó su relación con la expresión del mismo. El teocinte Zea luxurians, pariente silvestre del maíz de origen guatemalteco, contiene cinco repeticiones de CCA y es probable que contenga este comportamiento debido posibles introgresiones de genes desde el maíz o bien los microsatélites en maíz son consecuencia de la evolución o coevolución con sus parientes silvestres (Phelps y Buckner, 1995) .

Estudios similares hechos por los mismos autores y Hall (1996), entre 7 teocintes y 3 líneas endocriadas de maíz, estudiaron al microsatélite CCAn así como la secuencia adyacente a este microsatélites, exhiben un alto grado de variabilidad y puede ser útil para la diferenciación entre especies o para establecer relaciones filogenéticas.

Echeverrigaray et al., (1996), encontraron en un estudio de análisis de “fingerprinting” para evaluar la diversidad genética entre líneas de maíz. Mediante la hibridación de ADN con sondas que corresponden a SSRs, determinaron que mediante el uso de la sonda puede determinarse en un dendrograma las proporciones de similaridad entre las diferentes líneas de maíz en estudio.

Uno de los principales problemas sobre los microsatélites es que es necesario conocer las secuencias repetitivas y las secuencias en los flancos. Es necesario para esto entonces realizar un arduo trabajo inicial de secuenciación del genoma de la especie para establecer cuáles son las secuencias repetitivas y cuales son los flancos acompañantes para diseñar los imprimadores y entonces aplicar la PCR y realizar ensayos para establecer la calidad de los microsatélites. Para especies cercanas al maíz como el sorgo (Sorghum bicolor), se trato de resolver el problema al usar datos de bases de datos en donde se contienen las secuencias genómicas del maíz (Brown et al., 1996). Estos autores usaron 23 pares de imprimadores generados por los microsatélites de maíz de GENEBANK^®. Estos experimentos arrojaron varios resultados:

1. no hubo productos

2. múltiples productos desde 20 hasta más de 1000 pares de bases (bp).

3. una discreta banda monomórfica

4. una discreta banda polimórfica.

La búsqueda en bases de datos como única estrategia para buscar microsatélites, en este caso, es improbablemente suficiente para proveer un rendimiento adecuado de marcadores en cualquier especie vegetal (Brown et al., 1996).

PERSPECTIVAS DE LOS MICROSATÉLITES

En la actualidad los microsatélites son considerados las más poderosas fuentes de polimorfismos. Es muy probable, si se resuelven los problemas de secuenciación, que terminen sustituyendo al resto de marcadores moleculares, al menos en las especies más estudiadas. Aunque aún no se comprende completamente el papel de los microsatélites en los procesos generales de herencia y expresión génica, su uso como marcadores ha sido ya manifestado y comprobado (Cregan y Quigley, 1997).

Por otro lado, una nueva generación de marcadores está surgiendo, los polimorfismos de nucleótidos simples (Single nucleotide polymorphisms) SNPs (léase “Snips”), son considerados como la más común forma de polimorfismos de ADN que puede ser hallado en cualquier genoma. En cultivos como el maíz, estos pueden ser usados para “fingerprinting” de germoplasma, conversión de retrocuces asistidos por marcadores o para el mejoramiento asistido por marcadores. Los SNPs son susceptibles de automatización y pueden ser potencialmente usados para crear un mapa genético de muy alta densidad. Algunos SNPs en regiones codificantes pueden ser estar altamente relacionados con la alteración de los fenotipos (Bhattramakki, et al., 2000).

En la técnica de los SNPs, la técnica de los “gene-chips”, el ADN correspondiente a miles de genes, es arreglado en pequeñas matrices (“chips”), es entonces hibridizado con ADN copia, previamente marcado, proveniente de un tejido seleccionado de antemano. La información es leída por un dispositivo especial y puede ser descargado directamente a una computadora donde es analizado (Montaldo, et al., 1998).