Riassunto Premesse. Gli studi fino ad oggi condotti hanno dimostrato che l’Helicobacter pylori (Hp) è l’agente causale della gastrite cronica antrale e risulta associato all’ulcera gastrica e duodenale, al carcinoma gastrico e al linfoma gastrico del tessuto associato alla mucosa (MALT).

Oltre ad una diagnosi certa si rende perciò necessario instaurare una terapia per l’infezione ed accertare che l’eradicazione sia avvenuta.

Metodi. Nel periodo Novembre 95 – Maggio 96 abbiamo studiato 49 pazienti con dispepsia. Tutti i soggetti sono stati sottoposti ad esofagogastroduodenoscopia (EGDS). Dai prelievi bioptici effettuati sono stati eseguiti: esame istologico, test rapido all’ureasi, esame batterioscopico diretto, esame colturale, test all’ureasi su agar. Nella stessa seduta è stato effettuato ad ogni paziente un prelievo venoso periferico per la ricerca degli anticorpi IgG anti Hp.

Risultati. L’esame colturale per la ricerca di Hp ha rivelato 32 pazienti positivi e 17 negativi; all’esame istologico 31 sono risultati positivi e 18 negativi (VP+ 100%, VP – 94%); l’esame batterioscopico diretto ha riscontrato 28 pazienti Hp+ su 32 (VP+100%, VP – 81%); la ricerca degli anticorpi IgG anti Hp ha evidenziato 34 pazienti Hp+ contro 32 (VP+ 94%, VP – 100%). Per i soggetti Hp+ all’esame colturale è stato effettuato l’antibiogramma con i seguenti antibiotici: amoxicillina, azitromicina, claritromicina e metronidazolo. Dei pazienti, 3 sono risultati resistenti al metronidazolo, 1 ad azitromicina e claritromicina. Dopo terapia, fra i soggetti metronidazolo sensibili 26/29 (89%) hanno dimostrato eradicazione, fra quelli metronidazolo resistenti 2/3 (66%) sono guariti.

Conclusioni. L’esecuzione di esame istologico, batterioscopico diretto e ricerca degli anticorpi anti Hp permettono la corretta classificazione dell’infezione nella quasi totalità dei casi; per confermare l’avvenuta eradicazione si devono eseguire, dopo 8-12 settimane dal termine del trattamento, esame istologico e batterioscopico diretto. In caso di mancata eradicazione si rende necessaria l’esecuzione del test colturale e dell’antibiogramma. Per il successivo follow-up non endoscopico del paziente eradicato si ricercano gli anticorpi IgG anti Hp. (Med Lab 1997;5:243-251).

Introduzione

Lo stato dell’arte relativo all’infezione da Helicobacter pylori (Hp) contempla la sua responsabilità nello sviluppo della gastrite cronica non specifica di tipo B'", la sua associazione all’ulcera gastrica, duodenale'', allo sviluppo del carcinoma gastrico e del linfoma del tessuto associato alla mucosa (MALT)" ".

Da ciò risulta evidente la necessita di diagnosticare con certezza la presenza dei batteri, instaurare una terapia efficace e verificare che l’eradicazione sia avvenuta.

Helicobacter pylori è un microrganismo gram negativo, spiraliforme, lungo circa 3 um e largo circa 0.5 um. Ha una superficie liscia dotata di flagelli unipolari; sintetizza ureasi, proteasi acida, catalasi, emolisina, ossidasi ed una tossina proteica vacuolizzante di P.M. 120 KD che sembra essere responsabile del danno mucoso soprattutto a livello duodenale.

Hp produce inoltre il fattore chemiotattico per neutrofili e monociti, fattori attivatori del complemento e stimolanti la produzione di PAF, leucotrieni e IL 6.

Una certa tolleranza verso valori di pH acidi o basici gli consente di colonizzare la mucosa gastrica. L’attività ureasica permette ai batteri di circondarsi di un’atmosfera alcalina, al riparo dall’effetto ostile dell’acidità gastrica e di svolgere vere e proprie azioni citopatiche. Per la diagnosi di infezione da Hp possono essere impiegati metodi diretti ed indiretti.

Le procedure dirette comprendono:

– l’esame istologico

– l’esame colturale

– l’esame batterioscopico diretto

– il test all’ureasi

– Polimerase Chain Reaction (PCR)

tra i metodi indiretti annoveriamo:

– il breath test

– il dosaggio degli anticorpi specifici

• il dosaggio dei pepsinogeni A e C

Per rivelare la presenza di infezione da Hp, nel nostro laboratorio, da circa 18 mesi, si esegue il dosaggio degli anticorpi della classe IgG anti Helicobacter pylori. In questo arco di tempo abbiamo testato oltre 150 soggetti di razza bianca e nazionalità italiana. Studiando 42 di questi pazienti che presentavano l’infezione da Hp, prima e dopo terapia eradicante, somministrata per 14 giorni (dati non pubblicati), è emerso che nel 18% circa dei casi non era avvenuta l’eradicazione. Questo dato e la sempre maggior evidenza in letteratura dell’isolamento di ceppi resistenti agli antibiotici, ci ha convinto ad eseguire nel nostro Laboratorio l’esame colturale e l’eventuale antibiogramma. Scopo del nostro studio è quello di valutare se l’esame colturale sia necessario anche per la diagnosi di infezione oppure solo in caso di mancata eradicazione e se l’antibiogramma, con le metodiche attualmente applicate, fornisca al clinico un’informazione utile nella formulazione e/o correzione dello schema terapeutico.

Materiali e Metodi

A partire dal Novembre 1995 abbiamo studiato 49 pazienti giunti all’osservazione clinica per vari disturbi dispeptici: 14 femmine e 35 maschi, di età compresa fra i 28 e gli 80 anni, con età media di 58.5, che non avevano mai praticato terapia eradicante per Hp né assunto inibitori della pompa protonica e/o antibiotici per altre patologie negli ultimi due mesi. Tutti i pazienti sono stati sottoposti ad EGDS ed a 4 biopsie, 2 in antro e 2 in corpo gastrico. Contemporaneamente all’EGDS è stato effettuato un prelievo venoso periferico per la ricerca degli anticorpi anti Hp della classe IgG. Il campione di sangue, raccolto in provetta di polistirene senza conservanti, è stato immediatamente centrifugato per 15’ a 3000 g ed il siero è stato separato dalla parte corpuscolata e conservato a – 20°C fino al momento della determinazione immunoenzimatica. Abbiamo utilizzato un ELISA quantitativo che impiega antigeni inattivati di Hp (Diagnostica Pharma, Rubano PD, Italia). I risultati ottenuti in termini di assorbanza sono convertiti in unità arbitrarie in base ad una curva dose- risposta costruita su 5 punti standard.D’intesa con i colleghi del Servizio di Endoscopia Digestiva abbiamo stabilito un protocollo operativo per standardizzare il più possibile le condizioni di prelievo, trasporto e conservazione del campione di mucosa gastrica utilizzato poi per i test diagnostici effettuati nel nostro Laboratorio.Due frammenti bioptici della misura di 2-3 mm vengono posti in una provetta sterile contenente 0,5 ml di soluzione fisiologica per evitare il disseccamento e conservati a +4 gradi centigradi fino al momento della consegna al laboratorio, per mantenere vitali i batteri. I frammenti invece destinati all’esame istologico vengono conservati in una provetta contenente formalina liquida tamponata al 10%.I prelievi di epitelio gastrico effettuati vengono sottoposti a:

l) esame istologico con colorazione di Giemsa e/o Warthin- Starry, eseguito presso l’istituto di Anatomia Patologica dell’Ospedale di Vicenza;

2) test rapido all’ureasi (CP test, Yamanouchi Pharma S.p.A. Carugate-MI, Italia) dove una soluzione contenente urea vira da giallo a rosa per effetto delle modificazioni del colore dell’indicatore a seguito dell’idrolisi di tale sostanza da parte di Hp, usualmente entro 20 minuti;

3) esame batterioscopico diretto con colorazione di Giemsa e/o di Gram;

4) test tradizionale all’ureasi su terreno Urea Agar Slants (BBL-Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA);

5) esame colturale eseguito su terreni Helicobacter Pylori Selective Agar e Trypticase Soy Broth Becton Dickinson™

La coltura viene eseguita su Helicobacter Pylori Selective Agar, un terreno arricchito e selettivo che grazie alla presenza di antibatterici (vancomicina, trimethoprim e cefsulodina) che limitano lo sviluppo di flora orale contaminante, di un antimicotico (amfotericina B) che contrasta lo sviluppo di muffe e del 7% di sangue lisato di cavallo favorisce una buona crescita di Hp.

La scelta di questi terreni si è resa necessaria per la facilità con cui la coltura, dato il lungo tempo di incubazione e l’elevato grado di umidità relativa richiesto, poteva essere inquinata soprattutto dalla crescita di muffe.

Hp è un germe microaerofilo e si ottiene la crescita ottimale in un ambiente con il 5% di ossigeno, 10% di anidride carbonica e l’85% di azoto ed elevato grado di umidità relativa (99-100%).

Per questi motivi la piastra di agar Hp viene posta in una giara con un generatore di microaerofilia (sistema BBL – Becton Dickinson – costituito da giara anaerobica Gas Pak più buste Campy Pak che producono un’atmosfera con una concentrazione di 5-12% di ossigeno, 7-12% di anidride carbonica e 80% di azoto), e sul fondo viene posizionato un tampone di carta bibula imbevuto di acqua per creare il necessario gradiente di umidità nell’ambiente.

Le piastre vengono incubate a 37 ºC per un massimo di 7 giorni, ma normalmente la crescita si nota al 3º-4º giorno. Si procede quindi all’identificazione del germe eseguendo le ricerche biochimiche di catalasi, ossidasi ed ureasi. La produzione di catalasi viene verificata con l’uso di una soluzione di perossido di idrogeno al 3%, quella di ossidasi con la prova di Kovacs usando striscioline reattive alla tetrametil-p-fenilendiamina (l'indicatore vira al blu lavanda se la reazione è positiva, Biotest Oxidase-Biotest, Dreieich, Germany), per identificare la presenza di ureasi viene insemenzato un tubo di Urea Agar Slant BBL l'’ureasi scinde l’urea contenuta nell’agar in NH3+CO2 con aumento del pH e il viraggio da giallo-arancio a rosa-rosso dell’indicatore).

Per tutti i pazienti il cui esame colturale è risultato positivo è stato eseguito l’antibiogramma.

Per il suo allestimento è necessario disporre di una buona quantità di microrganismi per sopperire alla loro difficoltà di crescita. Usualmente prepariamo per questo scopo una piastra di Helicobacter Pylori Selective Agar insemenzata in modo da essere ricoperta completamente. È da tenere presente che mentre per la prima semina bisogna attendere almeno 3 giorni per la crescita di Hp, sui trapianti la comparsa delle colonie solitamente avviene in soli 2 giorni. Raggiunta una buona carica, raccogliamo con un tamponcino di cotone sterile la quantità di germi necessaria per ottenere in 1 ml di Trypticase Soy Broth sterile una torbidità di n. 3-4 Mac Farland (sospensione molto torbida). Per l’esecuzione dell’antibiogramma abbiamo utilizzato il metodo di Kirby Bauer modificato. Per sopperire il più possibile alle esigenze del germe ed alla difficoltà di lettura dell’alone, l’antibiogramma viene eseguito su terreni al sangue Trypticase Soy Agar + 5% sangue di montone (TSA-Becton Dickinson). Si allestiscono le piastre imbevendo un tampone sterile nel brodo e strisciandolo sull’agar in tre direzioni diverse in modo da ottenere una crescita abbondante.

I dischetti di antibiotico usati contengono le seguenti concentrazioni: amoxicillina 25 µg, azitromi-cina 15 µg, claritromicina 15 µg, metronidazolo 80 µg (BBL Sensi Disc Becton Dickinson ed Oxoid Antimicrobial Susceptibility Test Disc - Unipath Ltd., Basingstoke, Hampshire, U.K.). Le piastre di TSA su cui viene posizionato il dischetto di antibiotico vengono incubate in ambiente microaerofilo con le stesse modalità della semina primaria. La rilevazione dell’alone di inibizione viene effettuata dopo 2 giorni. La lettura non è agevole in quanto la crescita non è abbondante ed è difficile vedere l’alone, tanto che a volte bisogna prolungare di un altro giorno l’incubazione. L’Hp status dei nostri 49 pazienti (presente Hp+, assente Hp – ) è stato stabilito in base all’esame colturale e/o all’esame istologico delle biopsie gastriche prelevate sia a livello dell’antro sia a livello del corpo. Sono stati considerati Hp+ i pazienti che presentavano positività ad almeno 1 dei due test.

Risultati

La Tabella I riporta i risultati del nostro studio.

L’esame colturale delle biopsie gastriche ha evidenziato 32 soggetti Hp+ e 17 Hp-. L’esame istologico ha dimostrato 31 soggetti Hp+ e 18 Hp – con sensibilità del 97%, specificità e VP + ottimale e VP – 94%.

L’esame batterioscopico diretto ha rivelato 28 pazienti Hp+ e 21 Hp –, con sensibilità dell’87%, specificità del 100%, VP – dell’81 %, VP+ del 100%.

Il test rapido all’ureasi, eseguito nell’ambulatorio di endoscopia al momento del prelievo bioptico, è risultato positivo in 25 pazienti e negativo in 24, sensibilità pari al 75%, la specificità del 94%, il VP – pari al 67% (8 falsi negativi) e il UP+ al 96% (1 falso positivo).

Il test all’ureasi effettuato in laboratorio su terreno di Christensen ha dimostrato 29 pazienti Hp+ e 20 pazienti Hp – con sensibilità 91%, specificità 100%, VP – 85%, VP+ 100%.

Tabella I. Prestazioni diagnostiche dei test utilizzati.

Per quanto riguarda la risposta anticorpale IgG dei pazienti esaminati abbiamo ottenuto i seguenti risultati: 34 Hp+ e 15 Hp –.

Perciò tale test ha evidenziato una sensibilità del 100%, una specificità dell’88%, un VP – del 100% e un VP+ 94%. L’antibiogramma eseguito su 32 soggetti con esame colturale positivo ha evidenziato 3 pazienti con ceppi resistenti al metronidazolo ed 1 a claritromicina ed azitromicina. I soggetti sono stati quindi suddivisi in due sottogruppi: metronidazolo-sensibili e metronidazolo-resistenti. Nel primo sottogruppo 26/29 hanno dimostrato eradicazione dopo terapia; nel secondo sottogruppo 2/3 erano guariti dopo sostituzione del metronidazolo con claritromicina.

Discussione

Basandoci sulla letteratura riguardante l’argomento abbiamo adottato le tecniche diagnostiche più adatte alle nostre esigenze e possibilità di laboratorio di medie dimensioni.

Avendo a disposizione limitate risorse sia in termine di personale che di tecnologia, abbiamo rivolto la nostra attenzione a metodiche di facile esecuzione e basso costo.

Tra queste l’esame batterioscopico diretto: inizialmente veniva eseguito con la colorazione di Gram, in modo da evidenziare la forma e l’affinità tintoriale del germe. Al microscopio ottico il germe che colonizza l’epitelio gastrico si presenta come un bacillo gram-negativo con una forma molto caratteristica: la maggior parte dei batteri presenta due anse volte in una direzione ed una terza ansa, intermedia, volta verso la direzione opposta, tale configurazione ricorda molto la silhouette del gabbiano in volo per cui è definita ad "ali di gabbiano". Data la distribuzione "a macchia" del microrganismo sulla mucosa gastrica, all’esame microscopico la presenza di numerosi Hp crea un’immagine tipica che si definisce a "volo di gabbiani". A nostro giudizio, la colorazione con il metodo di Giemsa dimostra una capacità di risoluzione migliore per l’iden-tificazione di quantità esigue di microrganismi. Per questo motivo nel nostro laboratorio vengono preparati ora due strisci, uno da sottoporre alla colorazione di Giemsa, mentre il secondo viene conservato per effettuare eventualmente una colorazione di Gram qualora si riveli necessaria (Figura 1).

Fig. 1 Esame microscopico di HP:colorazione di Giemsa (dx) e Gram (sx)

In coltura, Helicobacter pylori forma colonie piccolissime, lucide, trasparenti, leggermente bombate (Figura 2). Dopo alcuni giorni di incubazione le colonie si allargano ed assumono una forma caratteristica a pedina di dama.

figura 2:Colonie di Hp in coltura

Alcuni lavori recenti hanno dimostrato che il microrganismo spiraliforme può assumere un aspetto "coccoide", specie se la coltura viene lasciata incubare per più di 10 giorni, durante i quali il terreno di crescita subisce un aumento della alcalinità. Si ipotizza che tale forma sia un adattamento del germe a condizioni ambientali sfavorevoli. In effetti abbiamo conservato delle colture su piastra per alcuni giorni in condizioni di crescita non idonee e verificato in tempi successivi la morfologia del germe con la colorazione di Gram . Con il passare del tempo il germe di forma bacillare tende ad assumere una forma arrotondata, con il margine meno netto e le dimensioni maggiori di quelle di un cocco: tale configurazione è definita forma coccoi-de, cioè il microrganismo si racchiude quasi ad esporre la minor quantità possibile di superficie esterna a quell’ambiente che gli è divenuto ostile.

Chan e coll. hanno dimostrato, con studi eseguiti al microscopio elettronico, che le forme coccoidi si possono trovare anche in vivo e la loro presenza starebbe ad indicare una particolare resistenza del germe agli antibiotici e/o sarebbe spia di una patologia ben precisa, come il carcinoma gastrico". Nella nostra esperienza non sono infrequenti i campioni in

cui l’esame batterioscopico diretto evidenzia alcuni cocchi insieme ai bacilli spiraliformi, non disponiamo però di metodiche adeguate per accertare se si tratti di Hp: la gram negatività, le dimensioni maggiori di questi elementi rispetto ai cocchi che solitamente albergano nella mucosa gastrica e l’assenza di sviluppo di cocchi gram-negativi ci fanno supporre che si tratti di forme coccoidi .

Possiamo affermare comunque che la morfologia del germe prelevato da coltura è molto diversa da quella che presenta in cimo, in quanto la spirale si distende quasi completamente e al massimo è possibile evidenziare una sola ansa, le dimensioni del bacillo sono maggiori, la forma è più tozza, l’affinità tintoriale per il rosa eosina è minore. Sono presenti contemporaneamente forme diverse: bastoncellari, ad uncino, corte spirali, coccoidi . Questo significa che pur crescendo in terreni arricchiti di elementi nutritivi il germe non trova lo stesso ecosistema che naturalmente la mucosa gastrica gli fornisce.

Per l’esecuzione dell’antibiogramma abbiamo valutato l’efficacia terapeutica dei seguenti antibiotici: amoxicillina, azitromicina, claritromicina, metronidazolo.

Come segnalato in letteratura anche noi abbiamo incontrato difficoltà nell’allestimento del test, soprattutto per la contaminazione da parte di muffe; inoltre abbiamo notato che data la tendenza del germe ad assumere la forma coccoide con l’invecchiamento, con capacità di riprodursi molto scarsa, è importante avere delle colture fresche fino alla fine del procedimento, in modo da poterle utilizzare se necessario.

Le dimensioni dell’alone di inibizione vengono registrate dopo 2 giorni di incubazione; come criterio interpretativo abbiamo seguito le indicazioni fornite dall’ NCCLS: il ceppo è considerato resistente quando il diametro è <18 mm per la claritromicina e < 17 mm per l’amoxicillina. per il metronidazolo non vi è ancora accordo sulla standardizzazione del diametro dell’alone di inibizione; nella nostra esperienza, per altro dimostrata anche da altri autori, abbiamo classificato un germe resistente a tale chemioterapico quando il diametro risultava < 31 mm .

Non è possibile a tutt’oggi definire con esattezza il grado di sensibilità per ciascun antibiotico poiché il microambiente gastrico in cui vive Hp presenta

cui l’esame batterioscopico diretto evidenzia alcuni cocchi insieme ai bacilli spiraliformi, non disponiamo però di metodiche adeguate per accertare se si tratti di Hp: la gram negatività, le dimensioni maggiori di questi elementi rispetto ai cocchi che solitamente albergano nella mucosa gastrica e l’assenza di sviluppo di cocchi gram-negativi ci fanno supporre che si tratti di forme coccoidi" .

Possiamo affermare comunque che la morfologia del germe prelevato da coltura è molto diversa da quella che presenta in cimo, in quanto la spirale si distende quasi completamente e al massimo è possibile evidenziare una sola ansa, le dimensioni del bacillo sono maggiori, la forma è più tozza, l’affinità tintoriale per il rosa eosina è minore. Sono presenti contemporaneamente forme diverse: bastoncellari, ad uncino, corte spirali, coccoidi . Questo significa che pur crescendo in terreni arricchiti di elementi nutritivi il germe non trova lo stesso ecosistema che naturalmente la mucosa gastrica gli fornisce.

Per l’esecuzione dell’antibiogramma abbiamo valutato l’efficacia terapeutica dei seguenti antibiotici: amoxicillina, azitromicina, claritromicina, metronidazolo.

Come segnalato in letteratura anche noi abbiamo incontrato difficoltà nell’allestimento del test, soprattutto per la contaminazione da parte di muffe; inoltre abbiamo notato che data la tendenza del germe ad assumere la forma coccoide con l’invecchiamento, con capacità di riprodursi molto scarsa, è importante avere delle colture fresche fino alla fine del procedimento, in modo da poterle utilizzare se necessario.

Le dimensioni dell’alone di inibizione vengono registrate dopo 2 giorni di incubazione; come criterio interpretativo abbiamo seguito le indicazioni fornite dall’NCCLS: il ceppo è considerato resistente quando il diametro è <18 mm per la claritromicina e < 17 mm per l’amoxicillina. per il metronidazolo non vi è ancora accordo sulla standardizzazione del diametro dell’alone di inibizione; nella nostra esperienza, per altro dimostrata anche da altri autori, abbiamo classificato un germe resistente a tale chemioterapico quando il diametro risultava < 31 mm .

Non è possibile a tutt’oggi definire con esattezza il grado di sensibilità per ciascun antibiotico poiché il microambiente gastrico in cui vive Hp presenta caratteristiche fisico- chimiche tali da richiedere l’uso di farmaci dotati di una cinetica particolare, specie per quanto riguarda la diffusibilità, il pK del farmaco e la sua azione in ambiente acido. Questo potrebbe spiegare una diversa sensibilità batterica in vivo ed in vitro.

In Tabella I sono riassunti i tests eseguiti per la diagnosi di infezione da Hp nei 49 pazienti studiati con relative percentuali di sensibilità, specificità, VP+, VP –.

Come si può notare dai dati ottenuti la specificità e la sensibilità del test colturale ed istologico non sono statisticamente differenti e sono le più elevate rispetto agli altri test; la maggior sensibilità del test colturale rispetto all’istologico (96%) è facilmente spiegabile in quanto la sensibilità del secondo è strettamente legata all’abilità ed alla pazienza dell'operatore nella ricerca microscopica dei batteri nel preparato. Nel nostro caso l’unica discrepanza tra i due test corrispondeva ad una carica batterica molto bassa che all’esame colturale si è manifestata con la crescita di poche colonie. In questo caso anche l’esame batterioscopico diretto è risultato negativo.

Debolmente positiva è risultata invece la presenza di IgG anti Hp.

Il VP+ e VP – del test colturale ed istologico sono ottimali, del resto tali esami rimangono il "golden standard" nella diagnosi di Hp.

Tuttavia per la più semplice esecuzione e per il costo inferiore, l’esame istologico sembra sia da preferire nella diagnosi routinaria di infezione da Hp, anche se resta da verificare la sua sensibilità nell’individuare le forme "coccoidi".

Buona anche la sensibilità, specificità e VP sia positivo che negativo dell’esame batterioscopico diretto. La sua rapidità e semplicità di allestimento, oltre al suo basso costo, permettono in breve tempo di orientare il clinico verso la diagnosi dell’origine della dispepsia, perciò può benissimo essere inserito negli esami di primo livello per la diagnosi dell’infezione di Hp. Tale test non permette di stabilire con esattezza il grading dell’invasione.

Il test batterioscopico diretto, l’istologico ed il colturale possono risultare falsamente negativi se il frammento bioptico non contiene l’Hp, data la distribuzione a macchia dei batteri nella mucosa gastrica affetta. In queste situazioni, molto utile si rivela la ricerca nel siero delle IgG anti Hp: sensibi-lità, specificità e VP di tale test, hanno dato ottimi risultati anche nello svelare infezioni con grading istologico basso. Un risultato negativo, esclusa una colonizzazione recente, nella nostra esperienza esprime un VP – molto elevato.

Dai risultati da noi ottenuti si può vedere come l’associazione tra esame istologico, batterioscopico diretto e ricerca degli anticorpi IgG anti Hp, permetta di diagnosticare l’infezione da Hp con sensibilità e specificità ottimali,

Il dosaggio degli anticorpi serici si è rivelato molto utile anche nel monitoraggio dell’infezione dopo terapia eradicante però a lungo termine: infatti il titolo anticorpale scende sotto il valore soglia almeno dopo 6 mesi dalla fine del trattamento.

Meno soddisfacenti si sono dimostrate sensibilità, specificità e VP del CP test, almeno di quello usato nel nostro studio, i dati ottenuti sono di scarso valore diagnostico.

Migliori caratteristiche ha presentato invece il test all' ureasi (terreno di Christensen) che nonostante il maggior tempo richiesto per ottenere l’esito ha dimostrato sensibilità, specificità e VP buoni.

Per quanto riguarda l’antibiogramma, abbiamo eseguito il test di suscettibilità agli antibiotici a tutti i pazienti che avevano presentato l’esame colturale positivo. Dei ceppi isolati, 28 su 32 (84%) si sono dimostrati sensibili a tutti gli antibiotici testati (amoxicillina, azitromicina, claritromicina, metmnidazolo), 3 (13%) si sono manifestati resistenti al solo metronidazolo, 1 (3%) resistente ad azitromicina e claritromicina. I pazienti sono stati quindi sottoposti a terapia eradicante (amoxicillina 1 g x 2 x 14 giorni, metronidazolo 250 mg x 4 x 14 giorni, omeprazolo 20 mg x 2 x 14 giorni), corretta nei casi in cui si era verificata resistenza del ceppo batterico ad uno dei che-mioterapici in vitro (sostituzione del metronidazolo con claritmmicina). L’avvenuta eradicazione è stata verificata dopo 8-12 settimane dalla fine del trattamento con esame istologico e batterioscopico diretto.

I pazienti sono stati suddivisi in due gruppi: quello degli affetti da Hp metronidazolo-sensibile e gli affetti da Hp metronidazolo-resistente.

Fra i soggetti con ceppi M-sensibili 26 su 29 (89%) hanno dimostrato la scomparsa del germe, fra quelli con ceppi M-resistenti 2 su 3 (66%).

Il soggetto M-resistente non eradicato aveva dimostrato all’esame batterioscopico diretto presenza di forme coccoidi.

Com’è noto la terapia eradicante per Hp non è definita in quanto nell’esperienza dei diversi ricercatori schemi terapeutici differenti sono caratterizzati da identica efficacia.

Il pannello di antibiotici da noi testato comprende i farmaci più impiegati ed efficaci nel trattamento dell’infezione nonché quelli che presentano i minori effetti collaterali; come si può notare abbiamo ottenuto una buona percentuale di eradicazione sia nei soggetti con ceppi M-sensibili che in quelli con ceppi M-resistenti, naturalmente dopo aggiustamento della terapia.

Analizzando i risultati fin qui discussi possiamo fare alcune considerazioni:

1) nella nostra zona (ovest-vicentino) la percentuale dei pazienti con ceppi di Hp resistenti in vitro al metronidazolo o ad altri antibiotici è ancora contenuta (16%) rispetto ad altre zone d’Italia o d’Europa;

con eradicazione ottenuta nei soggetti con ceppi M-sensibili è buona (89%);

3) la percentuale di eradicazione ottenuta nei pazienti con ceppi M-resistenti (66%) dopo la modifica dello schema terapeutico apportata in seguito alle informazioni fornite dall’esecuzione dell’antibio-gramma è migliore rispetto a quella riportata da lavori recenti'.

Conclusioni

Il Laboratorio ricopre un ruolo importante nei diversi momenti diagnostici dell’infezione da Hp. Nel nostro servizio per formulare la prima diagnosi di infezione si eseguono l’esame batterioscopico diretto ed il test sierologico per la ricerca degli anticorpi IgG anti Hp. Essi supportano, con tempi più rapidi, l’esame istologico svolto presso altra sede, il cui esito giunge al clinico almeno dopo 2 settimane.

L’associazione di questi 3 test ha dimostrato un VP+ e VP- molto elevati nell’identificazione o esclusione dell’infezione da Hp; ciò rende a nostro avviso non necessaria l’esecuzione dell’esame colturale al momento della diagnosi.

Per confermare l’avvenuta eradicazione, dopo 8-12 settimane dalla fine della terapia, a sostegno dell’esame istologico eseguiamo l’esame batterioscopico diretto, che grazie alla sensibilità dimostrata nell’individuare le forme "coccoidi" risulta molto utile soprattutto nei casi di resistenza agli antibiotici.

Per il successivo follow-up non endoscopico del paziente eradicato si ricercano gli anticorpi IgG anti Hp. In caso di mancata eradicazione invece diviene necessaria l’esecuzione dell’esame colturale con il relativo antibiogramma; ciò infatti ci ha consentito, modificando gli antibiotici somministrati, di migliorare la percentuale di eradicazione nei soggetti trattati, elevandola, in particolare nei pazienti metronidazolo resistenti, in rapporto ai dati di letteratura disponibili.

                                                               parte II

L'isolamento di Helycobacter pylori (precedentemente denominato Campylobacter pylori) è stato descritto nel 1983 da Marshall e Warren(Warren JR , Marshall B:Unidetified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis.Lancet 1983;1:1273-5.): una scoperta che avrebbe meritato da tempo il premio Nobel.

Questo reprint è tratto  da un depliant della Biomerieux.

Prelievo

La ricerca dell'Helicobacter pylori viene effettuata preferibilmente da biopsia gastrica antrale prelevata durante una gastroscopia, evitando che il prelievo venga effettuato in concomitanza di una terapia antibiotica. Bisogna aver cura di risciacquare il materiale utilizzato per il prelievo poichè in precedenza sarà stato disinfettato con glutaral-deide.

L’ideale è disporre di 3 frammenti. Uno per l’anatomo-patologo mentre gli altri due saranno destinati alla ricerca ed identificazione del batterio con le tecniche qui descritte.

H. pylori è un batterio la cui vitalità viene ridotta dal contatto con l’ossigeno, II prelievo viene trasportato a 4º C in soluzione fisiologica senza particolari precauzioni, ma è necessario seminario in un siero entro l’ora successiva e quella della biopsia. E' dunque preferibile utilizzare un terreno di trasporto specifico in grado di impedire lo sviluppo di eventuali contaminanti e di creare un ambiente umido e povero di ossigeno. Il prelievo deve essere immediatamente messo in agar. Il trasporto viene effettuato a temperatura ambiente.

La semina in laboratorio deve essere effettuata nelle 24-48 h successive al prelievo.

La ricerca, direttamente al livello di biopsia, di un’attivitk ureasica rapida ed intensa è un elemento di primaria importanza a favore della presenza di Helicobecter pylori.

Questa ricerca pud essere effettuata in laboratorio o in sala d’endoscopia.

A seconda dei reattivi utilizzati, della temperatura d’incubazione e dell'intensità dell'attività, la po-sitività della reazione patri essere osservata in un tempo molto variabik: da 15 minuti a 8 ore,

È preferibile destinare un frammento bioptico per la ricerca di questa attivitk ureasica e per l’esame diretto, mentre un altro frammento può essere usato per la coltura.

Colorazione di Gram

Dopo lo schiacciamento d’un frammento di biopsia su un vetrino, fissare e poi colorare la preparazione con il metodo Gram. Per aumentare la sensibilità di questo esame diretto è auspicabile aumentare il tempo abituale di decolorazione (prelievo mucoso) e della colorazione di contrasto (germi più contrastati).

Osservare attentamente l’insieme della preparazione al microscopio (x 1000).

La distribuzione dei batteri è talvolta molto eterogenea (per zone sparse).

H. pylori si presenta sotto forma di bacilli Gram-negativi sovente spiraliformi o ricurvi, da 2,5 a 5 µm di lunghezza e da 0,5 a 1  di larghezza, aventi da 4 a 6 flagelli polari.

Terreno di coltura

È necessario seminare un terreno ricco. La crescita di H. pylori è favorita in particolare dall’ap-porto di plasma di cavallo.

Poiché il prelievo 6 spesso contaminato dalla flora orale, è preferibile utilizzare un terreno reso selettivo dall’aggiunta di una miscela specifica d'antibiotici. Le miscele utilizzate per l’isola-mento del Campylobacter a partire dalle feci si sono rivelate troppo inibitrici per certi ceppi di H. pylori. L’Agar pylori contiene plasma di cavallo e una miscela di antibiotici la cui formula è finalizzata a a ncerca di questo germe.

Condizioni di coltura

H. pylori è un batterio microaerofilo la cui sensibilità all’ossigeno 6 maggiore rispetto a quella

del Campylobacter. L’atmosfera ideale per la crescita è costituita dal 54Fo d’ossigeno, dal 104Fo

di anidride carbonica e dall’85%o di azoto.

È dunque essenziale utilizzare un generatore di microaerofilia posto in una giara o in una busta

di plastica a chiusura stagna.

H. pylori si sviluppa meglio in un’atmosfera molto umida.

La temperatura d’incubazione deve essere di 35 - 37ºC.

Alcuni ceppi, in effetti, non si sviluppano nemmeno a 42ºC.

In queste condizioni, le colonie appaiono in 3-7 giorni in una coltura primaria, o in 2-4 giorni

in una subcoltura.

Le colonie sono piccole - cirm l mm; trasparenti, lucenti, discretarnente bombate, tonde e regolari.

La colorazione di Gram, realizzata partendo da una colonia, mostra dei bacilli Gram-negativi, ricurvi, a virgola, a forma di C, di U o di S, o in corte spirali.

Le colture evolvono rapidamente, nel corso di subcolture, verso forme degenerate d’aspetto coccoide.

L’identificazione è basata sulla determinazione di caratteri biochimici:

- ossidasi e catalasi positiva;

- ureasi fortemente positiva.

Si pud ugualmente ricercare su una sospenzione batterica densa (punto 6 deila scala di McFar-land) la presenza di gamma glutamil transpeptidasi (gamma GT) e di fosfatasi alcalina (PAL).

Altri tests, come l’idrolisi dell’ippurato e la riduzione dei nitrati sono negativi.

La riduzione del tasso di recidiva ulcerosa dopo eliminazione del germe, dimostrata in parecchi studi, è un elemento a favore del trattamento,

In vitro, H. pylori è sensibile a numerosi antibiotici:

p-lattamine (Penicillina e Cefalosporine), aminosidi (salvo neomicina).

È resistente alla vancomicina, trimethoprime, cotrimoxazolo.

Sono stati descritti dei ceppi resistenti al metronidazolo.

Reprint Da "Medicina di Laboratorio Vol 5, N. 3,1997".L'articolo è stato acquisito con il programma OCR Cuneiform 3.1:  http://www.ocr.com