LISTERIA e ERYSIPELOTHRIX
(vedi ingrandito)
Listeria è un bastoncello gram positivo che non è capace di
formare delle endospore. Sebbene esistano molte specie di questo batterio, le più
importanti per la patogenesi umana sono: L. monocytogenes e L. ivanovii. In
particolare, L. monocytogenes è stata implicata in molte epidemie di tossinfezione
alimentare.Questo normale abitante del tratto gastro intestinale di animali causo'
nel 1986 una epidemia in pazienti ricoverati in un ospedale del Massachusetts. I pazienti
infettati accusarono vomito, nausea e diarrea. Apparrentemente , i pazienti ricoverati
contrassero il microbo da cibo infettato dello stesso ospedale e diventarono ad alto
rischio di infezione. In particolare nel caso di una infezione ospedaliera, i pazienti
a più alto rischio sono i neonati, le donne incinte e i loro feti, gli anziani e
le persone immunodepresse. Questo batterio può causare setticemia e meningite in pazienti
con funzione immunitaria soppressa.Causa in particolare la listeriosi che è un
infiammazione del cervello.Gli antibiotici sono raccomandati per il trattamento della
infezione dato che molti ceppi di Listeria sono sensibili alla ampicillina e alla
gentamicina.
(vedi ingrandito)
Vengono riconosciuti 5 gruppi di
Listeria in base alle omologie DNA.Oltre questi 5 gruppi è stato riconosciuto un genere
diverso, il genere Borrelia.Le listerie patogene per l'uomo appartengono al 1° gruppo.Al
secondo gruppo troviamo Listeria bulgarica che interessa solo eccezionalmente
l'uomo.Il secondo gruppo è uno status non pienamente riconosciuto come gruppo
tassonomico.La Listeria bulgarica è stata dimostrata appartenere al
secondo gruppo di omologia DNA/DNA ma non è stata ufficialmente riconosciuta la dizione L.
bulgarica per il 2° gruppo di omologia. Oltre il secondo gruppo troviamo Listerie
saprofite :si trovano nelle acque,nel terreno, nel suolo , nelle mani .
Listeria monocytogenes è un patogeno dell'uomo che causa
meningite.Viene al 5° posto come frequenza di meningite batterica dopo Haemophilus
influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococco
di gruppo B.Come epidemiologia è più frequente in zone a diffusa zootecnia e
pastorizia.Nel caso di meningite neonatale è il secondo patogeno dopo lo Streptococco di
gruppo B.Nella meningite degli anziani è altresi' al secondo posto dopo lo
pneumococco.L'uomo viene infettato dal contatto con gli animali ma soprattutto con
l'ingestione di cibo infetto.
Il caso avvenuto a L'Aquila nel luglio 1998 riguardava un ragazzo di 13 anni residente in
un paesino di campagna.Non risulta trattarsi di immunodepresso.La grave meningite da
Listeria ha condotto il bambino in coma , dopo un primo ricovero in Pediatria, in
rianimazione.
Listeria cresce sui comuni terreni di coltura e la temperatura non
è selettiva.In Francia venne trovato durante una epidemia nel 1989 nei formaggi
Brie e Camembert, un episodio che determino' il blocco delle importazioni
dall'Inghilterra.Nell'uomo troviamo portatori fecali negli allevatori,
macellai,veterinari, pastori, gente che vive e lavora a contatto con gli animali.Dal punto
di vista clinico la meningite neo-natale da Listeria non è distinguibile da quella dello
SGB.Si differenzia però per i tempi.lo SGB dà una forma precoce entro i 6 mesi di vita,
mentre la Listeria entro la 1a settimana.La meningite è correlata al parto
prematuro.Cioè è piu' frequente nei neonati da parto prematuro e le complicanze
ostetriche facilitano la insorgenza di questa listeriosi.L'infezione puo' nascere o da un
passaggio della Listeria attraverso la placenta oppure da una infezione al momento della
nascita se il canale del parto è colonizzato dalla Listeria.La forma di meningite
tardiva si verifica dopo la 1a settimana di vita e normalmente entro il 1°
mese.Siamo a forme piu' precoci rispetto allo streptococco di gruppo B ed è
soprattutto una forma a carico delle meningi o meningo encefalite.Dopo il 1° mese di vita
l'incidenza della listeria è bassa per rialzarsi dopo il 60mo anno o comunque negli
immunodepressi.
Come si ricerca:se abbiamo campioni normalmente sterili come sangue,
liquor,liquido amniotico non ci sono grossi problemi e anche un esame diretto aiuta alla
diagnosi.Lo si trova anche nelle secrezioni genitali.Lo si isola da prelievi bioptici, da
campioni di placenta e anche nel tessuto fetale abortito (è causa di aborto negli animali
e nell'uomo).Quando si subcultura una caratteristica è che le sub culture sono resistenti
ai 4°C e anzi crescono anche a 4°C cioè a temperatura di frigorifero.Percio' sono
facili a conservarsi in frigorifero e quando dobbiamo inviare il ceppo a un laboratorio di
riferimento non abbiamo problemi.
Per la ricerca dei portatori fecali bisogna fare l'arricchimento
a freddo.Si fa una sospensione fecale in un qualunque brodo arricchito.Si
subcultura una volta a settimana per 4 settimane in frigorifero.Quindi si subcultura una
volta al mese per altri 2 mesi.Quindi dopo 3 mesi si cerca di isolare la Listeria.I ceppi
si conservano a - 70°C in sangue di coniglio defibrinato.Dai campioni normalmente sterili
quali il liquor l'aspetto del microorganismo ci puo' dare qualche indizio.Si puo'
confondere solo con i corinebatteri, lo pneumococco, lo streptococco, gli
enterococchi.Attenzione: quando si decolora troppo nella colorazione del Gram spesso si
confonde con un gram negativo per esempio un emofilo.Quindi se si decolora troppo, dato
che prima della coltura è un batterio pleiomorfo piccolo si puo' pensare all'emofilo.Si
puo' colorare il vetrino con anticorpi fluorescenti ma sono poco usati in
laboratorio.Oppure si puo' tipizzare con le sonde genetiche.
Da' una caratteristica beta emolisi stretta, piccola che non eccede la colonia per cui per
notarla bisogna scostare la colonia e sotto si nota l'emolisi completa.Dato che
l'emolisi è piu' evidente se si fa una infissione nel terreno è consigliabile fare una
infissione.E' una emolisi interessante.La differenza con l'emolisi dello streptococco di
gruppo B è questa: lo SGB dà il Camp test postivo cioè l'emolisi si amplifica quando si
semina il batterio a fianco di una coltura di Stafilococco aureo.Orbene anche Listeria da'
questo curioso fenomeno ma è una emolisi piu' rotondeggiante.La Listeria bulgarica invece
da' questo fenomeno non con lo Stafilococco aureo ma con il Rhodococcus equi.Dato
che pochi laboratori dispongono del ceppo di Rhodococcus equi, questo test è
difficile da eseguire.Per fortuna Listeria bulgarica riguarda piu' la
microbiologia veterinaria che non la microbiologia umana.Ricordiamo che questi ceppi
ATCC sono anche in vendita.Vedi anche il sito http://www.gbf.de/dsmz/dsmzhome.html dove
richiedere questi ceppi.
Una altra caratteristica
distintiva di Listeria è che se si osservano le colonie che crescono sull'agar PALM ,che
è piuttosto trasparente, a luce incidente, le colonie sembrano iridescenti verdastre.Ma
questa caratteristica si nota poche volte.Anche il gruppo di ricerca all'ISS che
lavora sulla Listeria non ha mai trovato questa caratteristica su questi terreni.Comunque
i terreni selettivi sono poco usati se non per fare ricerche epidemiologiche.
Dal punto di vista batterioscopico nei campioni clinici lo si
ritrova sia all'interno che all'esterno delle cellule mentre nei preparati da brodocoltura
le listerie hanno una disposizione a palizzata e tendono ad allungarsi un pochino.
La caratteristica mobilità si nota con la crescita ad ombrello
quando seminato su agar molle, cioè lungo la linea retta di infissione e verso l'alto del
terreno inoculato si apre come un ombrello cioè 
la Listeria tende a muoversi piu' vicina alla superficie del
terreno.Non c'è problema a differenziare la Listeria dallo streptococco perchè è
catalasi positiva.Spesso questo semplice test viene dimenticato!Basta fare una sospensione
della colonia e metterci una goccia di H2O2 per chiarirci molti dubbi.Con i difteroidi di
origine epiteliale e contaminanti ogni dubbio si elimina osservando la motilità.I
difteroidi sono immobili tranne un saprofita il Corynebacterium aquaticum.Quando
cerchiamo di isolare la Listeria da un formaggio o alimento dove si sospetta ricordiamoci
di questo corinebatterio.Comunque Listeria è Voges Proskauer positivo mentre i difteroidi
sono VP negativi cioè non producono acetilmetilcarbinolo da glucosio.E' anche RM positiva
.Non riduce i nitrati a nitriti ed è ureasi negativa.La listeria potrebbe essere confusa
solo con Erysipelothrix rusiopathiae che è un batterio gram positivo H2S
positivo su TSI, l'unico gram + con questa caratteristica, ed è immobile.
Attenzione anche agli enterococchi che sono permissivi alle temperature
come Listeria , come essa puo' crescere in presenza di NaCl al 10%, cresce sugli stessi
terreni degli enterococchi e aderisce al terreno come essi.Quindi puo' crescere su bile
esculina e annerire il terreno.E' come gli enteroccchi ippurato positiva.Ha una forma
cocco bacillare e forma qualche volta delle catenelle coccobacillari ed essendo anche
enterococco un poco allungato , è facile confonderli.Come detto basta una banale test
della catalasi per fugare ogni dubbio.Inoltre ci sono dei batteri gram negativi del gruppo
KESH che pure avendo colonie piu' grandi possono crescere su bile esculina e annerire il
terreno dando colonie piccole.Ma sono ippurato negativi.
La listeriosi è una zoonosi.L'arrivo all'uomo è
accidentale.Possiamo distinguere infezioni di organo che danno problemi
oculo-ghiandolari, infezioni all'apparato respiratorio inferiore e superiore, forme
dell'apparato digerente, ghiandole annesse e le forme urogenitali.Distinguiamo listeriosi
linfogene e ematogene.Le listeriosi a diffusione ematogena danno gravi meningoencefaliti,
nonchè forme miliari del feto e del neonato, le sepsi generalizzate che possono
manifestarsi come encefalite sub acuta o come forme settico anginose.Se si instaura una
forma anginosa e' benigna, se si instaura una forma setticemica allora una forma
meningoencefalitica è facilmente mortale.Perchè si chiama Listeria monocytogenes?La
mononucleosi infettiva è sostenuta dal virus Epstein Barr ma un tempo si sospettava la
Listeria.A certe forme di listeriosi è associata una mononucleosi relativa che
arriva fino al 75% di monociti nella formula leucocitaria.L'emocromo spesso con questa
formula mette in allarme.Una mononucleosi infettiva prima di essere sicuri che non
è leucemia mette paura!Ma la listeriosi con una percentuale di monociti molto alta
rispetto alla mononucleosi infettiva è una forma piu' grave perchè c'è anche una sepsi
batterica
Ritornando a Erysilopethrix rusiopathiae è un gram + più lungo
della Listeria.E' un anaerobio facoltativo, si decolora piuttosto facilmente e quindi puo'
passare a gram incerto o a gram negativo.Dà colonie che si trovano 2 fasi.Una fase S
liscia, composta da batteri più piccoli di quelli prelevati da colonie ruvide, mentre
quelli prelevati da colonie ruvide sono più lunghi.Tende a uno spiccato pleiomorfismo a
seconda del terreno di coltura su cui è coltivato.Tende a cambiare 1)forma,
2)disposizione, 3)grandezza passando da terreno solido a uno liquido o da un terreno
solido a un altro o da un terreno liquido ad un altro liquido.C'è da diventare pazzi,
perchè sembra di avere a che fare con dei germi diversi.Da un batterio piccolo, cocco
bacillare può dare forme lunghe filamentose non ramificate e che a differenza dei
difterici non danno granuli.Produce H2S su TSI ed è molto facile riconoscerlo per
questo.Utilizza lattosio e glucosio.
Provoca il cosidetto mal
rossino nei maiali e nell'uomo l'erisipeloide (simile all'erisipela).E' trasmessa anche
dagli animali marini, contratta da persone che praticano la pesca sportiva,la coltivazione
dei molluschi, i pescatori.Si manifesta come lesione infiammatoria delle dita e della mano
e questa lesione ha un angolo sollevato e tende a spandersi e man mano che si espande si
decolora al centro della lesione.La lesione cutanea non è molto grave ma puo' evolvere a
setticemia o endocardite che sono forme gravi.Si è anche osservata setticemia in assenza
di una lesione cutanea.Erysipelothrix va segnalato anche su lesioni infette in assenza di
questa lesione caratteristica.Se troviamo un gram positivo non consideriamolo subito uno
sporigeno contaminante.Va segnalato.E' più alta l'incidenza in allevatori.Vi furono dei
casi in USA da lavatori infetti con la lavorazione dei bottoni di osso.La polvere di ossa
era contaminata.Il terreno può contenere l'Erysipelothrix perchè resiste.E' stato
isolato da terreni di vecchie porcilaie abbandonate.Cinque anni dopo nel terreno c'era
ancora il batterio.
Dalla lesione cutanea fare una biopsia sull'angolo della lesione e per tutto lo spessore
della lesione:è il metodo più sicuro.Ma la persona interessata non è molto
d'accordo!L'alternativa è iniettare una fisiologica tiepida scaldata (come nella
tularemia) all'angolo della lesione (dove c'è il linfonodo) e riaspirare senza avere
ritirato l'ago:quindi fare un lavaggio della lesione e aspirare la soluzione
fisiologica senza fare cose cruente.I campioni, sia quelli bioptici sia quelli ottenuti
con l'aspirato vanno messi in brodo glucosato 1% e mandati subito al laboratorio.Nel caso
dell'Erysipelothrix un esame diretto è inutile perchè si presenta come un gram + in
mezzo a tanti altri.Se la disinfezione della cute è stata accurata prima del prelievo,
non è necessario utilizzare un terreno selettivo per l'erisipelotrix.Per l'isolamento
primario si usa questo brodo glucosato all'1% dalla lesione che va subculturata ogni 24
ore per una settimana.Dà una emolisi sotto la colonia nelll'agar sangue.Basta scostare la
colonia.Per gli studi sulla fermentazione usiamo l'indicazione di Andrade.Al brodo
contenente gli zuccheri si aggiunge del siero di coniglio.Anche per studiare il Cardiobacterium
hominis si aggiunge del siero di coniglio per le prove di fermentazione.
L'indicatore di Andrade è
il migliore indicatore per le fermentazioni.Non si trova in commercio ma è molto facile
da preparare. Più invecchia e meglio funziona.Dopo 10 anni è eccellente vira
ancora meglio.Bisogna procurarsi la fucsina acida e se ne fa un sale sodico trattandola
con soda.Si lascia sul bancone e si aggiunge soda finchè tutta la fucsina non sia
diventata di un colore giallo paglierino.Si dà una agitatina ogni tanto.L'indomani se il
colore è rimasto giallo è pronta altrimenti si aggiunge altra soda finchè non si
stabilizza sul giallo dopo di che si filtra su carta e rimane stabile per anni! E' molto
conveniente dal punto di vista delle fermentazioni dato che non dà colori che
interferiscono con quelli del brodo e soprattutto non ha punti di viraggio che alle volte
sono indecifrabili.In altre prove si usa il porpora di bromocresolo.Nel passare dal viola
deciso al giallo, passa per tutta una gamma di colori intermittenti grigi-giallastri
strani che non si capisce se indicano una fermentazione.Il porpora di bromocresolo
ha un altro svantaggio:ci sono i batteri del gruppo KESH che se ne nutrono.Decolorano
l'indicatore a prescindere dalla fermentazione, lo degradano e quindi perde
colore.L'indicatore ha il vantaggio di essere incolore e di passare a un colore molto
deciso rosa-shocking a pH < 5.5 e quindi anche un inizio di fermentazione è molto
evidente.E' un indizio di fermentazione sia debole o ritardata nel tempo.E'
l'indicatore da usare dove si fanno prove di fermentazione per ricerche tassonomiche.Non
costa nulla.Altra caratteristica di Erysipelothrix è la liquefazione della gelatina.Il
termostato deve essere fissato a 25 °C o fare crescere la coltura a 37°C e poi porre le
piastre in frigorifero.La gelatina liquefa a 37°C però ritirando le provette dal
termostato quelle che solidificano non significa che liquefano la gelatina mentre dove non
si è risolidificato vuol dire che si è sciolta.La liquefazione della gelatina si puo'
vedere anche a 37°C.Per vedere la forma della liquefazione però c'è bisogno chiaramente
del termostato a 25°C perchè a 37°C tutta la gelatina liquefa e non se ne parla
più.Erisipelotrix dà una liquefazione della gelatina a forma di scovolino (come
quelli che servono a pulire le provette) molto caratteristica.La diagnosi di conferma si
fa con un classico postulato di Koch che è l'inoculazione nei topini.Si può inoculare
nel peritoneo circa 0.1 ml di brodocoltura di 18-24 ore in topi di controllo e in quelli
da esperimento si inocula 0.1 ml di brodocoltura 18-24 h e 0.3 ml di siero
iperimmune anti Erysipelothrix che però non è facile procurarsi.I topi di controllo
muoiono dopo 24 ore mentre quelli coperti si salvano.Questa è la diagnosi di conferma di
infezione da Erysipelothrix.
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