หน้าที่ 1 l 2 l 3
คลิกเพื่อออกความคิดเห็นครับ


 

การเพิ่มปริมาณดีเอนเอในหลอดทดลอง

ประวัติความเป็นมา

เทคนิคพีซีอาร์ถูกค้นพบโดย Dr. Kary Mullis ในปี ค.ศ.๑๙๘๔ ซึ่งขณะนั้นเป็นนักวิจัยของบริษัท Cetus ทำงานเกี่ยวกับ การหาลำดับเบสของดีเอนเอ Dr. Kary Mullis มีความคิดขึ้นมาในคืนหนึ่งว่าน่าจะเป็นไปได้ที่จะสามารถเพิ่มจำนวนดีเอนเอ ต้นแบบในหลอดทดลองโดยใช้ DNA polymerase เร่งปฏิกริยาในการต่อสายนิวคลีโอไทด์ในหลอดทดลอง และ มี substrate คือ deoxynucleoside triphate ในสภาวะที่เหมาะสม Dr. Kary Mullis ประสบความสำเร็จในการทดลองสร้างดีเอนเอสายใหม่ และ สามารถเพิ่มจำนวนดีเอนเอได้เรื่อยๆเป็นทวีคูณอย่างไม่มีที่สิ่นสุด และได้นำเสนอผลงานของเขาในที่ประชุมประจำปีของบริษัทในฤดูใบไม้ผลิ PCR จึงเป็นที่รู้จักและนิยมนับจากนั้นเป็นต้นมา

หลักการของปฏิกริยาลูกโซ่โพลีเมอ์เรส

PCR ย่อมาจาก Polymerase Chain Reaction คือ การเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนดีเอนเอที่ต้องการขึ้นในหลอดทดลองด้วยการทำปฏิกริยาอย่างต่อเนื่องเป็นลูกโซ่โดยอาศัยเอนไซม์ DNA polymerase ซึ่งปฏิกริยามีหลักการพื้นฐานคือการใช้ไพรเมอร์ ซึ่งเป็นดีเอนเอเส้นเดี่ยวท่อนสั้นๆ ๒ เส้น เป็นจุดเริ่มต้น ในการสร้างดีเอนเอเส้นใหม่ขึ้นมา และเอนไซม์ DNA polymerase เร่งปฏิกริยาต่อสาย โดยนำนิวคลีโอไทด์ ๔ ชนิด (A.T.C.G. ) มาต่อกันซึ่งดีเอนเอเส้นใหม่จะมีลำดับเบสที่เป็นคู่สมกับดีเอนเอต้นแบบ

องค์ประกอบปฏิกริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส

1. ดีเอนเอต้นแบบ (DNA template)คือ เส้นดีเอนเอที่ต้องการเพิ่มปริมาณ โดยดีเอนเอที่สร้างขึ้นใหม่จะจำลองตัวผสมดีเอนเอต้นแบบนี้
2. ไพรเมอร์ (primer) คือดีเอนเอเส้นเดี่ยวสายสั้นๆจำนวน ๑๐-๒๕ เบส ซึ่งใช้เป็นตัวเริ่มต้นในการสร้างสายดีเอนเอที่ต้องการ
3. dNTPs (deoxynucleoside triphosphate) คือ dATP, dTTP, dCTP, และ dGTPใช้เป็นสารตั้นต้นของปฏิกริยา
4. เอนไซม์ Taq DNA polymerase และ บัฟเฟอร์ คือ เอนไซม์ที่ทำหน้าที่ในการสร้างดีเอนเอมีคุณสมบัติพิเศษ คือ สามารถทนความร้อนสูง(๙๓-๙๕ องศาเซลเซียส) ได้
5. เครื่อง PCR (themal cycler) คือเครื่องเปลี่ยนอุณหภูมิแบบอัตโนมัติ เพื่อทำให้เกิดปฏิกริยาแบบต่อเนื่องในการเพิ่มปริมาณดีเอนเอ

ขั้นตอนของปฏิกริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส

1. Denaturation คือการทำให้ดีเอนเอเสียสภาพธรรมชาติจากที่เคยเป็นเส้นคู่กลายเป็นเส้นเดี่ยว เพื่อเปิดโอกาศให้ไพรเมอร์เข้าไปจับกับบริเวณที่ต้องการเพิ่มปริมาณบนสายดีเอนเอต้นแบบ โดยใช้อุณหภูมิสูง ๙๔-๙๕ องศาเซลเซียส เพื่อทำลายพันธะที่ใช้ในการจับคู่กันของเส้นดีเอนเอ

    

 ที่มา : http://www.nhrbc.org/paper15.5.html

2. Annealing หลังจากที่เส้นดีเอนเอแยกเป็นเส้นเดี่ยวแล้วลดอุณภูมิมาที่ ๕๐-๕๕ องศาเซลเซียส ไพรเมอร์ซึ่งเป็นดีเอนเอเส้นเดี่ยวท่อนสั้นๆ จะเข้าไปเกาะบริเวณที่ที่เป็นคู่ผสมกันบนเส้นดีเอนเอต้นแบบ

ที่มา : http://www.nhrbc.org/paper15.5.html


Created by Suhaiming Moksu (Ming)
Contact webmaster : suhaiming@muslimthai.com

หน้าหลัก l การแยกดีเอนเอจากสิ่งมีชีวิต l การเพิ่มดีเอนเอในหลอดทดลอง l บทปฏิบัติการ l ผู้จัดทำ