OBJETIVO:

El alumno aislara el ácido nucleico desoxiribonucleico (ADN) a partir de células hepáticas (hepatocitos) e identificara por pruebas colororimétricas algunos de sus componentes básicos.

INFORMACIÓN GENERAL:

Existen 2 tipos principales de ácidos nucleicos: El ADN ( ácido desoxiribonucleico) y el ARN (acido ribonucleico).Los ácidos nucleicos son biopolímeros sumamente importantes dentro de las células, su principal función es participar en la síntesis de proteínas, y además, participar en los fenómenos de reproducción celular, en cuanto a su estructura química, los ácidos nucleicos constan de la unión de numerosos nucleótidos, estos nucleótidos estan formados por una base nitrogenada que puede ser ; purica ( adenina o guanina) o bien pirimidinica (citosina, timina o uracilo), constan también de un azúcar pentosa (ribosona o desoxirribosa ), y además fósforo.

El ácido desoxiribonucleico o ADN para el caso de las células eucarióticas se encuentra principalmente dentro del núcleo, aunque una pequeña porción del mismo se encuentra dentro de las mitocondrias, el ADN tiene una estructura tridimensional de una doble hélice, en la cual las bases nitrogenadas se encuentran siempre apareadas Guanina con Citosina y Adenina con Timina, se estima que el genoma humano haploide contiene alrededor de 3,000 millones de pares de bases.

Materiales	Reactivos
Trozo de Hígado Cuchillo Licuadora Gasa Embudo Buchner Bomba de vacío Vaso pp 250 ml (2) Varilla de vidrio Probeta 50 ml (2) 3 tubos ensayo 10x12 mm Pipeta Pasteur 3 pipetas 1 ml Centrífuga Tubos de polirtileno50 ml para centrífuga Palillo de madera (largo) Hielo	Sal común Solución detergente sulfato lauril sódico Proteasa Alcohol etílico Äcido sulfúrico Reactivo de Bial Molibdato de amonio Reactivo de Fiske-Subarow

Desarrollo del experimento

1.-Pesar 50 gramos de hígado, cortarlo en trozos pequeños, pasarlos a un vaso de licuadora y añadir 100 ml de agua destilada fría más 10 gramos de sal común.

2.-Licuar a máxima velocidad por aproximadamente 30 segundos

3.-Filtrar a través de una capa fina de gasa colocada sobre un embudo Buchner, usar bomba de succión en caso de que sea necesario

4.-Pasar el filtrado a un vaso de precipitados de 250 ml y añadir 25 ml de solución detergente.

5.-Mezclar por 3 minutos lentamente y con cuidado el filtrado y la solución detergente usando una varilla de vidrio, IMPORTANTE TRATAR DE NO HACER ESPUMA AL MEZCLAR

5.-Dejar reposar la mezcla durante mínimo 10 minutos

6.-Pasar la mezcla a un tubo de ensayo llenando solamente 1/3 del volumen del tubo de ensayo y añadir una pizca o pequeña cantidad de enzima proteasa, agitar el tubo suavemente. PRECAUCIÓN SI SE AGITA CON VIOLENCIA SE VA A ROMPER EL ADN, VA A SER DIFICIL VERLO

7.-Ladear el tubo de ensayo y lentamente y por las paredes del tubo ir virtiendo alcohol etílico frío en una cantidad igual al volumen del filtrado que ya hay en el tubo.

PRECAUCION, LA ADICIÓN DEL ALCOHOL SE HACE LENTAMENTE Y POR LAS PAREDES DEL TUBO.

8.-Dejar reposar la mezcla por 30 minutos mínimo

9.- Colectar el ADN usando un palillo largo de madera para extraerlo del tubo

Resultados esperados

Si el procedimiento fue llevado a cabo de manera apropiada tal y como se describe en la práctica , observaras que el ADN (en forma de una sustancia blanca filamentosa, de aspecto viscoso) se desprendió de la muestra y se eleva hasta la superficie de la capa de alcohol, desde donde puede ser recuperada usando el palillo.

HIDRÓLISIS DEL ADN E IDENTIFICACIÓN DE SUS COMPONENTES

A.- IDENTIFICACIÓN DEL AZUCAR PENTOSA

1. Tome 0.2 gr. Del precipitado obtenido, colocarlo en un tubo de ensayo y añadirle 2 ml. De H2SO4 13 N.

2. Hierva a la flama del mechero ( suavemente ), agitando , durante 10 min.

3. Retire con una pipeta pasteur una pequeña porción del hidrolizado

4. Coloque 6 gotas del hidrolizado en un tubo de ensayo pequeño

5. Añada 0.5 ml de reactivo de Bial y agite.

RESULTADOS ESPERADOS

La presencia de azúcar pentosa ( desoxiribosa), que contiene el ADN, se manifiesta por la aparición de un color verde azuloso, debido a la reacción del furfural (producido al usar H2SO4 sobre el carbohidrato), mas el orcinol que contiene el reactivo de Bial.

B.- IDENTIFICACIÓN DE FOSFATO

1. Tome con una pipeta pasteur aprox. 1 ml del hidrolizado y pasarlos a un tubo de ensayo

2. Añada 0.5 ml. H2SO4 10 N y 1 ml. De molibdato de amonio al 2.5%

3. Añada 1 ml. De reactivo de fiske-subarow y dejar reposar 10 min.

RESULTADOS ESPERADOS

Se debe desarrollar un color azul, debido a la reacción del naftol-sulfonato sodio con el fosfato presente en el ADN (el naftol-sulfonatol es el principal componente del reactivo de Fiske-Subarow)

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