PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA No. 11
OBJETIVO:
El alumno aislara el ácido nucleico RNA a partir de células hepáticas, aplicara además las pruebas químicas que demuestren su presencia en el extracto obtenido.
INFORMACIÓN GENERAL:
los ácidos nucleicos son biopolímeros sumamente importantes dentro de las células, su principal función es participar en la síntesis de proteínas, y además, participar en los fenómenos de reproducción celular.
Existen 2 tipos principales de ácidos nucleicos:
El DNA ( ácido ácido) y el RNA (acido ribunucleico).
Los ácidos nucleicos son también son precursores de
nucleoproteinas.en cuanto a su estructura química, los ácidos nucleicos constan
de la unión de numerosos nucleótidos, los cuales a su vez tienen: una base
nitrogenada que puede ser ; purica ( adenina o guanina), pirimidinica
(citosina, timina o uracilo), consta también de un azúcar pentosa
(ribosona o desoxirribosa ), y además fósforo.
Los compuestos que poseen los tres elementos : base nitrogenada, azúcar y fósforo, reciben en nombre de nucleótidos. Aquellos que carecen de fósforo reciben el nombre de nucleosidos. Es decir, los nucleosidos, forman nucleótidos cuando se les añade fósforo a la molécula.
Para el caso de RNA, existen 3 tipos dentro de las células: RNA mensajero, RNA de transferencia y RNA ribosomatico, la estructura química es semejante , lo que varia es su peso molecular, tamaño, forma tridimensional, y sobre todo la función que desempeña.
MATERIAL REACTIVOS
3 pipetas de 10ml. Fenol 90%
3 pipetas de 1 ml. Acetato de potasio
1 varilla de vidrio 200g/lt ph 5
2 vasos de p.p. 250 ml etanol
1 probeta de 50 ml. Éter etílico
1 vaso de p.p. 500 ml. Reactivos de fiske-subarow
3 tubos de ensayo 18 x 150 mm. Molidato amonio 2.5 %
1 trozo de gasa H2SO4 13 N
1 mechero H2SO4 10 N
1 tripie reactivos de bial
1 tela asbesto sulfito de sodio 20%
1 guantes de hule sulfito ácido de sodio 15%
1 centrifuga
1 bomba de vació
1 embudo buchner MATERIAL BIOLOGICO
1 matraz kitasato
1 cuchillo 50 g de hígado de res
hielo en cubos
DESARROLLO DEL EXPERIMENTPO:
11.1 ASILAMIENTO DE RNA
1. pesar 50 g de hígado. cortarlo en trozos pequeños.
2. pasar los trozos a un vaso de precipitado de 250 ml. Y añadir 25 ml. De agua destilada fría.
3. colocar una gasa fina en un embodo fichner. Conectar el embudo al kitasato y este a la bomba de vació y aplicar succión.
4. filtrar el homogenizado de hígado a través del embudo y recibirlo en el kitasato.
5. HUTILICE GUANTES DE HULE EN ESTE PASO. Añade rápidamente el filtrado, sin dejar de agitar con una barrilla de vidrio, 25 ml. De fenol al 90%
6. pasar la solución del paso anterior a un vaso de precipitados de 250 ml. Añadirle un imán y colocarlo en el agitador mecánico por 30 min.
7. enfriar en baño maría de hielo picado
8. centrifugar a 3000 r.p.m. por 15 min.
9. decantar y conservar el sobrenadante
10. enfriar de nuevo en baso maría de hielo picado el sobre nadante
11. centrifugar de nuevo a 3000 r.p.m. durante 5 min.
12. medir el volumen de sobenadante recolectado y agar una décima parte de este volumen de acetato de potasio al 20 % (ph 5)
13. agregar lentamente y agitando, un volumen al doble del sobrenadante de alcohol absoluto frió
14. enfriar por 5 min. en baño maría de hielo
15. centrifugar 5 min. a 3000 r.p.m.
16. pese el peso del papel filtro que va a utilizar en el paso 17 .anote este peso
17. prepare el equipo de filtración al vació de la siguiente forma; A) coloque un papel
18. filtro dentro del embudo fichner,B) monte el embudo sobre un matraz kitasato, C) conecte el kitasato a la bomba de vació y encienda la bomba
19. pasar la solución del paso 15 al embudo buchner
20. lavar con 10 ml. De alcohol absoluto (etanol)
21. lave con 10 ml. De éter
22. secar al aire y pesar para calcular el rendimiento considere restar el peso del papel filtro usado
11.1 –
RESULTDOS ESPERADOS
al final delos pasos anteriores, se espera que usted haya asilado el RNA del resto de los componentes presentes en las células hepáticas. Se procederá a comprobar la presencia de algunos de los elementos presentes en los ácidos nucleicos.
11.2 HIDRÓLISIS DEL RNA E IDENTIFICACIÓN DE SUS COMPONENTES
A.- IDENTIFICACIÓN DEL AZUCAR PENTOSA
La presencia de azúcar pentosa ( ribosa), que contiene el RNA, se manifiesta por la aparición de un color verde azuloso, debido a la reacción del furfural (producido al usar HCL sobre el carbohidratos), mas el orcinol que contiene el reactivo de bial.
RESULTADOS ESPERADOS
Se debe desarrollar un color azul, debido a la reacción del naftol-sulfonato sodio con el fosfato presente en el RNA.
(el naftol-sulfonatol es el principal componente del reactivo de fiske-subarow)
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