PRACTICA DE BIOQUÍMICA PARA VETERINARIA No 12
OXIDACION MITOCONDRIAL DEL SUCCINATO
OBJETIVO
El alumno demostrara la oxidación mitocondrial del
succinato, utilizando un aceptor artificial de electrones, la cantidad del cual
será determinada por espectrofotometría.
INFORMACION GENERAL
Los animales superiores son heterótrofos, es decir,
no pueden sintetizar su propia energía (como lo hacen las plantas en la
fotosíntesis), sino que deben ingerir esa energía en los alimentos que
consumen, y posteriormente extraer parte de la misma mediante una compleja
serie de reacciones bioquímicas.
La principal fuente de energía para los animales y el
hombre son los carbohidratos, el metabolismo energético de estos compuestos
incluye reacciones como la glucólisis, ciclo de Krebs y la cadena
respiratoria. Dependiendo de si las
condiciones microambientales son aerobias (con presencia de oxigeno), o
anaerobias (en ausencia de oxigeno), las reacciones proseguirán por una vía, o
bien, se detendrán a cierto nivel.
La mitocondria, es un pequeño organelo celular en
donde se llevan a cabo las reacciones que requieren la presencia de oxigeno. En
la mitocondria se hallan numerosas enzimas que hacen posible la oxidación de
los metabolitos del ciclo de Krebs.
La oxidación puede implicar: ganancia de oxigeno,
perdida de hidrogeno, o mas específicamente, perdida de electrones.
La producción de energía por parte de la mitocondria,
implica el transporte de electrones a lo largo de una cadena de reacciones y de
varias maneras, una de ellas, es la colorimétrica, usando un aceptor artificial
de electrones, el cual cambia de color cuando capta dichos electrones.
Para medirá con exactitud el grado en el cual se
produce el cambio de color, se usara un aparato muy común en el laboratorio de
bioquímica, el espectrofotómetro.
Sin entrar en muchos detalles, este aparato nos mide
la cantidad de luz que atraviesa un medio coloreado (transmitancia), o bien,
nos puede medir la cantidad de luz que es retenida o absorbida por ese medio
coloreado (absorbancia).
A mayor cantidad de substancias coloreadas tenga una
muestra, mayor cantidad de luz será capaz de absorber, pero ello también
dependerá del espesor de la cubeta (los tubos de cuarzo donde se colocan las
muestras dentro del aparato).
Para el caso de la práctica, se usará como aceptor
artificial de electrones al ferrocianuro (se usará ferrocianuro de potasio).
Esta substancia es de color amarillo, y a medida que
va aceptando electrones, va haciéndose cada vez más pálida. A mayor cantidad de
electrones aceptados, más pálida se vulva la solución, esta disminución de
color se puede mediar con gran exactitud usando el espectrofotómetro.
MATERIALES REACTIVOS
4 tubos de ensayo 120 x 10mm Buffer de fosfatos pH 7.4 0.1M
1 gradilla Succinato
en buffer 0.01M
3 pipetas de 1ml Malonato en buffer 0.01M
2 pipetas de 0.1ml Cianuro
de potasio
2 vasos p.p. 250ml1 baño Maria Ferrocianuro de potasio 0.01M
1 termómetro Ácido
tricloroacético al 10%
1 mortero y mano1 trozo de gasa
1 centrifuga con tubos MATERIAL BIOLÓGICO
1 espectrofotómetro con cubetas Trozo de corazón de res
(fresco).
1 licuadora
hielo picado
DESARROLLO DEL EXPERIMENTO.
1.
Pese
2.
Pique
finamente el trozo de corazón, añada 190ml de buffer de fosfatos bien frío.
3.
Coloque
en un vaso licuador y licue por 1 minuto.
4.
Filtre
a través de gasa fina y recoja el filtrado en un vaso de precipitados.
5.
Coloque
en baño Maria de hielo el vaso de precipitados que contiene el filtrado (homogenizado).
6.
Numere
3 tubos de ensayo y proceda como muestra el esquema:
Tubo
1 Tubo 2 Tubo 3
Buffer de fosfatos
3ml 2ml 1.9ml
Succinato en buffer 1ml 1ml
Malonato en buffer 0.1ml
___________________________________________________________________
Homogenizado del
paso No 5 1ml 1ml 1ml
NOTA: Checar que esté bien mezclado.
___________________________________________________________________Cianuro de potasio 1 gota 1 gota 1 gota
7.
Colocar
los tubos en un baño Maria a
8.
Añadir
a cada tubo 1ml de ferrocianuro de potasio. Mezcle bien, anotar el tiempo al que se hizo la adición.
9.
Diez
minutos después agregue a cada tubo 5ml de ácido tricloroacético. Mezcle bien.
10.
Centrifugue
cada tubo por 5 minutos a 2,000 r.p.m.
11.
Obtenga
el sobrenadante de cada tubo y tome la lectura de la
absorbancia en el espectrofotómetro, a
una longitud de onda de 420nm. NOTA: UTILICE AGUA DESTILADA COMO BLANCO PARA
CALIBRAR EL APARATO.
12.
Calcule
el numero de micromoles de ferrocianuro que quedan en cada tubo, para ello considere lo siguiente:
a)
La
Extinción molar (E) del ión ferrocianuro es de 1 X 10 3 litros mol
b)
El
volumen total en cada tubo, luego de la adición del ácido tricloroacético es de 10ml.
c)
La
longitud del rayo de luz que atraviesa la cubeta es de 1-
FORMULA A EMPLEAR PARA LOS CALCULOS
C = A_
EB
C = Concentración
A = Abosorbancia medida en
el espectrofotómetro
E = Exticnción molar (1 X
10 3 mol
B = Espesor de la cubeta (cms)
Micromoles
de Fe (CN) 3 Micromoles
de Fe (CN) 3
Al
final de la reacción usados
por el sistema
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
12. Resultados esperados
Tubo 1. ------ No contiene el substrato (succinato),
solo el buffer, de aquí que no exista oxidación, por lo tanto es el tubo que
conserva más cantidad de ferrocianuro
sin
aceptar electrones (y sin cambiar de color).
Tubo 2. ------ La
presencia del substrato (succinato), en este tubo, permite que dicho succinato se oxide, proceso que
implica un transporte de electrones, los cuales
son
captados por el ferrocianuro, el cual se va decolorando
a medida que ello ocurre. Este tubo debe dar el valor mas alto de micromoles de
ferrocianuro empleados por el sistema enzimático y el menos numero de
micromoles de ferrocianuro que quedan después de terminada la reacción.
Tubo 3. ------ La presencia del malonato
que contiene este tubo, actúa como un inhibidor de tipo competitivo para la
succinato deshidrogenasa (la enzima que cataliza la remoción de hidrogeno del
succinato). Por lo tanto, el succinato al no oxidarse, se mantiene. Este tubo
debe dar, en base a lo señalado, un valor de micromoles de ferrocianuro que
quedan después de la prueba, mayor al del tubo No 2.
Regresar a página principal de prácticas de laboratorio de bioquímica :
http://www.oocities.org/mvz_jmtz/labbioq.html