PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA NO. 6

AMIOACIDOS : SEPARACION POR CROMATOGRAFIA PAPEL

OBJETIVO

El alumno comprenderá el importante papel que desempeñan los aminoácidos en el cuerpo de los animales, conocerá algunas de sus propiedades y, en base a estas separara los aminoácidos presentes en una mezcla, usando la técnica de cromatografia en papel.

INFORMACION GENERAL

Los aminoácidos son los monomeros (unidades), de que están formadas las proteínas (y por ello también las enzimas).

Químicamente, se caracterizan por la presencia en su molécula de un grupo carboxilo en el carbono No 1 ó alfa, y un grupo amino, unido al carbono No 2 ó beta (de aquí su nombre de aminoácidos).

Existen en la naturaleza mas de 200 aminoácidos diferentes, sin embargo, dentro del cuerpo de los animales, solo existen 22 principales, de estos 22, 10 son considerados como esenciales.

El termino aminoácido esencial, se aplica en aquellos aminoácidos que no pueden ser sintetizados, o que son sintetizados en cantidad menor a la requerida, de ahí que forzosamente tengan que ingerirse en los alimentos que se consumen.

Para los animales domésticos revisten carácter de esencial los siguientes aminoácidos: Lisina, Triptofano, Histidina, Fenilalanina, Leucina, Isolaucina, Treonina, Metionina, Valina y Arginina

Los aminoácidos considerados no esenciales, si pueden ser sintetizados por los animales a partir de otros compuestos de la dieta.

Los animales pueden unirse entre si para formar péptidos (algunos autores consideran péptido como sinónimo de aminoácido, pero por lo general se usa el termino para designar a la unión de varios de ellos). La unión de 2 aminoácidos se designa como dipéptido, si son 3 tripéptido, etcétera. Cuando el numero de aminoácidos unidos es grande, se designa como polipéptido, y si cumple ciertos requisitos, se llama proteína.

Los aminoácidos tienen diferentes propiedades físicas y químicas, las cuales pueden ser aprovechadas para diferenciarlos.

Los aminoácidos compuestos incoloros, cristalinos, a granel se presentan como polvo blanco. Las formas cristalinas son muy características y van desde agujas (tirosina), hasta placas hexagonales gruesas (cistina). El sabor varia desde dulce azucarado (glicina), pasando por el insípido (tirosina) hasta el amargo (arginina).

Tienen diferente afinidad por el agua y otro tipo de solventes, y pueden poseer carga electrica positiva algunos negativa otros, o bien, algunos son neutros (carecen de carga electrica).

El termino cromatografía fue propuesto por Tswett en 1903 para la separación de pigmentos vegetales en una columna de sílice.

Hoy en día, la técnica original ha sufrido numerosas modificaciones, mejoras y adaptaciones de tal forma que existen muchos tipos de cromatografía (de adsorción, de reparto, de intercambio ionico, de tamiz molecular), y muchas técnicas especiales para usar estos tipos (en columna, en papel, en capa fina, en gases). Algunas técnicas son muy costosas y sofisticadas, otras son sencillas y baratas.

La cromatografia puede aplicarse para separar carbohidratos, lípidos, aminoácidos, proteínas y otros compuestos.

Para esta practica, se pretende separar los aminoácidos presentes en una mezcla, por la cromatografia en papel.

Está basada en el hecho de que los diferentes aminoácidos se absorben en el papel con diferentes grados de afinidad para un solvente determinado.

MATERIALES	REACTIVOS
Cámara cromatográfica	Alanina
Cubeta para cámara cromatográfica	Leucina
Papel Whatman para cromatografia	Lisina
Estufa bacteriológica	Valina
Regla	Butanol
	Ac. Acético
	Agua destilada
	Ninhidrina spray

DESARROLLO DEL EXPERIMENTO

1. Preparar una tira de papel Whatman para cromatografía, marcando con un lápiz una línea de aplicación a 2.5 cm de uno de los extremos

2. Colocar una gota del problema (solución de mezcla de aminoácidos), exactamente en el centro de la línea de aplicación. Deje secar en el aire

3. Colocar el papel en la cubeta de la cámara cromatogafica.

La cubeta deberá contener al liquido solvente (Butanol - Ac. Acético - Agua destilada 4:1:1)

4. Después de hora y media quitar las tiras de la cámara, marcar el frente del solvente (con lápiz), y dejar secar las tiras a temperatura ambiente

5. Asperjar las tiras con una solución de ninhidrina en spray.

Secar al aire

6. Colocar las tiras en la estufa a 100° C durante 10 minutos.

7. Con la ayuda de una regla, medir la distancia a la que avanzo el solvente con relación a la línea de aplicación y anotar el valor. Medir también la distancia de las manchas (las cuales representan los diferentes aminoácidos, con respecto a la línea de aplicación.)

8. Calcular el valor de Rf (Rf representa la relación de distancia a que se ha movido un aminoácido con respecto a la distancia en que se ha movido el solvente). Este valor Rf, es especifico para cada aminoácido y para un solvente determinado, de aquí que podamos identificar de que aminoácidos se trata al comparar sus valores de Rf.

Distancia a que se movió el aminoácido

Rf = ----------------------------------------------------

Distancia a que se movió el solvente

6. Resultados esperados

La tira de papel contiene los aminoácidos, y al ser rociada con ninhidrina, esta substancia oxida los aminoácidos, dando un color púrpura.

Debido a sus diferentes pesos y propiedades, los aminoácidos tienen diferentes grados de adsorción en el papel. Aquellos que se absorben mas fuertemente se mueven a distancia mas corta, los que se absorben menos en el papel, se mueven por lo tanto a distancia más larga.

Los resultados al final de la prueba que se espera obtener son:

Valor Rf	Aminoácido al que corresponde este Rf (Con solvente Butanol 4: ac.- acético 1: agua 1)
0.14	Lisina
0.38	Alanina
0.60	Valina
0.73	Leucina

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