Inmunofluorescencia indirecta
ANCA Vasculitis Moléculas de adhesión Técnicas de laboratorio Detección de ANCA Otras Publicaciones Sobre ANCA Del autor Recomendados El autor Créditos		Objetivo   Detectar la presencia o ausencia de ANCA en suero humano mediante leucocitos polimorfonucleares fijados en etanol.

Material

Preparaciones de neutrófilos sobre portaobjetos esmerilados.

Cubetas de lavado.

Cámaras húmedas.

Microscopio óptico de fluorescencia.

Reactivos

PBS

IgG (rabbit anti-human) FITC

Fosfato (PO4^3-)

Cloruro sódico (NaCl)

p-fenilendiamina

Bicarbonato sódico (NaHCO₃)

Glicerina (C₃H₈O₃)

Métodos

Preparación de los reactivos

Medio de montaje: solución de cloruro sódico-fosfato tamponada

0.01 m PO4^3-, pH 7.4

0.15 m NaCl

100 mg p-fenilendiamina + 10 ml de PBS + 90 ml glicerina.

Ajustamos el pH-8  con 0.5 M de carbonato-bicarbonato tamponado a pH-9

Conservamos a –20^oC preservado de la luz.

Técnica

1. Diluimos el suero problema y los controles
2. Lavamos los portas  preparados (preparación de neutrófilos fijados) en PBS, 5 minutos.

3. Secamos los restos de PBS y los colocamos en una cámara húmeda.
4. Alicuotamos 100 ul de cada suero sobre la preparación de neutrófilos.
5. Incubamos entre 30 y 45 minutos en cámara a temperatura ambiente.
6. Lavamos 5 minutos en PBS x 3
7. Añadimos 100 ul del anticuerpo conjugado con FITC
8. Incubamos en cámara húmeda y oscura durante 30-45 minutos.
9. Lavamos 5 minutos en PBS x 4
10. Secamos y  montamos la preparación en la solución de glicerol-fosfato. Es un “antifading” que evita el efecto “bleaching” que la fuente de luz tiene sobre la inmunofluorescencia.

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