LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE
ANALISI DEL DNA:
Preparazione di sonde di acidi nucleici:
Sonde a DNA a singolo e doppio filamento, sonde ad RNA
Marcatura terminale al 5, e al 3,, marcatura interna.
Metodi radioattivi e non (colorimetrici e chemiluminescenti)
Denaturazione e rinaturazione del DNA
Ibridazione:
Applicazioni.
Ibridazione in soluzione.
Tecniche per lo studio del processo di riassociazione.
Fattori che influenzano la riassociazione.
Fattori che influenzano la stabilità del duplex.
Ibridazione su filtro:
Fattori che influenzano la Ibridazione su filtro.
Tipi di filtri.
Southern e Northern blotting.
Dot blot.
Ibridazione su colonie batteriche.
Ibridazione in situ.
PCR
Fattori che determinano la specificità della tecnica.
Tipi particolari di PCR: Nested PCR, PCR asimmetrica, Anchored PCR, etc.
Uso della tecnica nella diagnosi di malattie genetiche e nella determinazione del sesso
del nascituro.
Isolamento di geni donati
Costruzione e screening di genoteche genomiche e di cDNA
Metodi di screening delle genoteche con:
sonde di acidi nucleici;
analisi del prodotto proteico;
traduzione selettivamente promossa (o arrestata) dall'ibrido.
Trasferimento genico
Trasferimento in cellule di lievito. Trasferimento in cellule di mammifero
Mutagenesi
Sintesi chimica di oligonucleotidi
Diagnosi delle malattie genetiche basata sul DNA
DGGE.
TGGE.
SSCP.
Polimorfismo dell’eteroduplex.
ANALISI DELL'RNA:
Analisi dei trascritti
Studio della regolazione genica
Studio della interazione DNA-proteine
EMSA, Footprinting in vivo, in vitro e in organello,
ANALISI DELLE PROTEINE:
Espressione e accumulo dei prodotti genici
Procedure di arricchimento di prodotti specifici.
Analisi dei prodotti proteici
Struttura di proteine che interagiscono con il DNA
Purificazione di DNA-binding proteins
One-hybrid system
Two- hybrid system
Three- hybrid system
Esercitazioni pratiche su alcune delle tecniche presentate durante il corso.