FRACCIONAMIENTO CELULAR

Si bien mediante la microscopía se puede determinar la disposición de los organelos y de los grandes agregados macromoleculares en las células y tejidos, muchos estudios bioquímicos requieren la obtención aislada de aquellas estructuras. Es así como surge el fraccionamiento celular, procedimiento que permite la separación de organelos y macromoléculas por ultracentrifugación. Para ello las células de una población purificada debe disgregarse en forma cuidadosa y controlada, ya sea por shock osmótico controlado, ultrasonido, haciéndolas pasar a través de un pequeño orificio o moliéndolas. Estos tratamientos rompen las membranas plasmáticas y otras membranas, pero dejan intactos los núcleos y la mayoría de los organelos.

Luego la mezcla del homogenado se somete a centrifugación por rotación en una ultracentrífuga. Cuanto mayor sea el número de revoluciones por minuto, mayor será la fuerza centrífuga ejercida. Esto permite separar los diversos componentes celulares mediante centrifugación diferencial; de acuerdo a sus tamaños y densidades sedimentarán a diferentes velocidades. En un primer paso, a una velocidad relativamente baja, sedimentarán células enteras, núcleos, restos de membranas y los componentes del citoesqueleto. Sometiendo a mayor velocidad al sobrenadante, se obtiene un “pellet” (sedimento) con la fracción que contiene mitocondrias, lisosomas, peroxisomas. A una velocidad alta y con mayor tiempo de centrifugación se separa la fracción que contiene las vesículas membranosas del retículo endoplásmico, llamadas microsomas, y otras vesículas pequeñas. Finalmente a muy alta velocidad y después de largo tiempo de centrifugación se obtienen ribosomas y grandes macromoléculas; quedando un sobrenadante que contiene otras biomoléculas, como por ej. proteínas solubles.

La obtención de estas estructuras aisladas tiene fundamentalmente por objeto estudios bioquímicos relacionados con ellas, como por ejemplo estudiar la respiración celular, alguna vía metabólica que ocurra en la fracción microsomal, etc. La centrifugación diferencial permite obtener un fraccionamiento inicial del contenido celular, que luego puede purificarse con más precisión mediante una centrifugación isopícnica o en gradiente de densidad. En este método se coloca en un tubo de ultracentrífuga una sustancia, tal como sacarosa o cloruro de cesio, en un gradiente de densidad, preparado con un aparato especial de mezclado (un formador de gradientes), de forma que la densidad aumenta desde la superficie hasta el fondo. Cuando se coloca una mezcla de componentes celulares sobre este gradiente de densidad y se centrifuga a alta velocidad, los distintos tipos de componente se separan en distintas bandas en las regiones del gradiente con igual densidad. Las fracciones celulares purificadas se recuperan con sólo punzar la base del tubo para recolectar las muestras. La velocidad a la que sedimenta cada uno de los componentes depende fundamentalmente de su tamaño y de su forma, y suele expresarse como coeficiente de sedimentación S. Actualmente las ultracentrífugas pueden alcanzar velocidades superiores a 80.000 r.p.m. y producir fuerzas de más de 500.000 veces la de la gravedad; así se pueden separar entre sí en función de su tamaño incluso las macromoléculas pequeñas como los ARNt y las enzimas sencillas.

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