Título:       Bacteriología de la laguna del Parque Sarmiento

Autoras: Bosque Analía, Aguada Mariana, Luján Belén, Moya Antonella y Asaduroglu Julieta

Asignatura: Proyecto de investigación

Sexto año del Nivel Medio del Ciclo de Especialización en Ciencias Naturales

Av. Revolución de Mayo 1476; Bº Crisol; 5014 Córdoba; Argentina

Director del proyecto: Prof. Federico Kopta

Jefe de Trabajos Prácticos del Laboratorio de Ciencias Naturales: Exequiel Di Tofino

Profesora de Microbiología y Salud: Beatriz Lázaro

Año: 2008

Abstract

This work contains the research work conducted in 2008, in connection with the bacteriology of the lagoon Sarmiento Park.

The most important results show that:

- In the cultivation of total coliform, the point that juvenile colony-forming units per milliliter won, was a point of sampling 1 (SE lagoon) with 54 cfu/ml, while the largest number that corresponded to the point of sampling 6 (N lagoon), with 450 cfu/ml.

- In the cultivation of Escherichia coli, the smallest spread was at the point 2 (S lagoon), with 3 cfu/ml and the maximum value, was presented at the point 6 with 100 cfu/ml. In all cases, exceeding the 1.26 cfu / ml (126 colonies per 100 ml) named in the interim version of the guide levels of water quality environment for direct contact with human recreation for Escherichia coli.

From these results it can be inferred that the presence of fecal contamination is recent and positive results with concern because of the high value they threw it, checking our assumptions and leading to look for possible causes to solve this problem.

Resumen

Este trabajo contiene el trabajo de investigación realizado en el año 2008, en relación con la bacteriología de la laguna del Parque Sarmiento.

Los resultados obtenidos más importantes muestran que:

- En el cultivo de coliformes totales, el punto que menores unidades formadoras de colonias por mililitro obtuvo, fue el  punto uno de muestreo (SE Laguna) con 54 ufc/ml, mientras que el que mayor número correspondió al punto seis de muestreo (N Laguna) con  450 ufc/ml. En todos los casos, supera las 50 ufc/ml (5.000 colonias cada 100 ml) mencionadas por DIPAS.

-En el cultivo de Escherichia coli, la menor proliferación fue en el punto dos, con 3 ufc/ml (S laguna sobre desagüe calle Paunero) y el máximo valor se presentó también en el punto seis,  con 100 ufc/ml. En todos los casos, supera las 1,26 ufc/ml (126 colonias cada 100 ml) citadas en la versión interina de los Niveles guía de calidad de agua ambiente para recreación humana con contacto directo correspondientes a Escherichia coli (Recursos Hídricos de la Nación, 2003).

De estos resultados se puede inferir que la presencia de contaminación fecal reciente es positiva y con resultados preocupantes debido al alto valor que arrojaron, comprobando nuestra hipótesis y conllevando a buscar las posibles causas, para solucionar dicho problema.

 

Introducción

El presente trabajo contiene  el plan de trabajo a realizar durante todo el ciclo lectivo del año 2008, en relación con la bacteriología de la laguna del Parque Sarmiento.

A continuación se hará una síntesis de factores fundamentales para dicha investigación.

    Al hacer el análisis de las aguas no buscamos tal o cual organismo patógeno, es decir, no aislamos o identificamos los microorganismos patógenos del agua, sino que averiguamos si esta contiene o no contaminación de origen fecal.

    Los microorganismos existentes pueden proceder de la propia agua, del aire y la tierra, o de las heces.

    Un recuento total  elevado puede ser síntoma de contaminación por bacterias extrañas al ecosistema, por el contrario, un conteo total bajo es un buen índice de la situación del agua objeto de estudio.

    La reglamentación española marca como valor orientativo de calidad no más de 10 bacterias/ mililitro de agua, y como valor máximo tolerable 200 bacterias/ml de agua. A consecuencia, si nos sale un valor mayor a  200 bacterias/ml de agua indica que el agua no es potable y podríamos recomendar una desinfección con cloro o lejía.” (Di Tofino, 2008)

   “A su vez, existen factores que inciden en la flora microbiana los cuales deben ser tenidos en cuenta:

·        La acidez disminuye el contenido de microorganismos.

·        La materia orgánica lo aumenta.

·        Mucho oxigeno disuelto disminuye los microorganismos anaerobios.

·        Las sales, si son abundantes, producen que el agua sea casi estéril.

·        Si existe poca cantidad de sales se estimula al desarrollo bacteriano.

·        El almacenamiento y la filtración disminuyen el número de microorganismos.

·        La temperatura puede aumentar o disminuir el contenido bacteriano.

·        La turbidez hace que el contenido bacteriano pueda aumentar, ya que los rayos UV no manifiestan su acción.

·        Lo protozoos fagocitan bacterias y así disminuyen el numero de estas.

     En función a la temperatura como parámetro y de acuerdo a la temperatura registrada durante las mediciones realizadas en la laguna, el cual arrojó un valor de 15º C aproximadamente, esta la clasificación del tipo de microorganismos  que esperamos encontrar en dicho medio es la de mesófilos, los cuales presentan un crecimiento óptimo en rangos de temperatura moderada. En general son microorganismos que se encuentran en animales de sangre caliente y en medios acuáticos y terrestres de latitudes tropicales.

     Los organismos  mesófilos tienen un valor limitado como indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas, un recuento total de aerobios mesófilos bajos, no aseguran que un agua este exenta de patógenos o sus toxinas, pero tampoco un recuento total alto significa, inevitablemente presencia de flora patógena.

     En función al pH registrado en la laguna el cual es de aproximadamente 7,5 los organismos que encontraremos serán organismos neutrófilos: microorganismos cuyo pH de crecimiento, es alrededor de 6-8.

 Microorganismos supuestos de la laguna.

 COLIFORMES TOTALES

     Son bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coniformes forman parte varios géneros: Escherichia

                                                                  Enterobacter

                                                                  Klebsiella

                                                                  Citrobacter

     Aunque su especificidad como indicador no es buena, se suelen usar como índices de contaminación fecal. Los coliformes son un indicador muy útil para determinar la posible presencia de virus y bacterias patógenas  entéricas en las aguas. El agua que no contiene coniformes totales se considera libre de bacterias productoras de enfermedades.” (Di Tofino 2008).

     La Dirección Provincial de Agua y Saneamiento (Dipas) se rige por parámetros que permiten la presencia de hasta cinco mil bacterias coliformes totales por cada 100 mililitros y de 1.000 para las coliformes fecales en aguas para uso recreativo. Empero, de acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS), tales parámetros no pueden exceder, en el primer caso, las mil bacterias por cada 100 mililitros de agua y 200 para las bacterias coliformes  fecales” (DiPAS). “Si las colonias coliformes en una sola muestra exceden de los  valores mas arribas citados deberían recogerse inmediatamente muestras diarias en el mismo punto de muestreo y examinarse hasta que los resultados obtenidos en, al menos dos muestras consecutivas, pongan de manifiesto que la calidad del agua, esta otra vez dentro de las normas.”

COLIFORMES FECALES

     La determinación la terminación de coliformes fecales en agua, en agua, es un análisis de contaminación fecal más reciente que la determinación de coliformes totales; por eso los coniformes fecales son el microorganismo patrón utilizado por muchos laboratorios.

     Consideramos coliformes fecales a:    Escherichia

Citrobacter

Klebsiella

     Se realiza la incubación a 44,5 º C (más menos 0,2º C)

·                   Las bacterias coniformes producen enfermedades entéricas.

·                   Escherichia coli produce dolor abdominal, diarrea, nauseas, vómitos, y fiebre. Una cepa de esta especie es responsable del Síndrome Urémico Hemolítico.

·                   Klebsiella produce enfermedades respiratorias.

·                   Citrobacter produce alteraciones a nivel del colon y a nivel intestinal.

Riesgos en la salud y el ambiente derivados del desborde de líquidos cloacales en las calles de Córdoba (válido para la contaminación de estos líquidos en la laguna del Parque Sarmiento)

 

“La presencia y circulación de líquidos cloacales crudos (sin tratamiento) a cielo abierto, pueden traer consecuencias de diferente tipo y gravedad, tanto para las personas que residen en las inmediaciones como para transeúntes frecuentes u ocasionales, entre las que pueden mencionarse:

 

Para la salud:

 

·       Las aguas cloacales sin tratamiento son portadoras de bacterias entéricas, como por ejemplo Escherichia coli (que precisamente es utilizada como un indicador de contaminación fecal de aguas). Si bien la mayoría de las cepas de esta bacteria son inocuas y viven en los intestinos de los seres humanos y animales saludables, existe una cepa (llamada O157:H7) que produce una potente toxina que es responsable de severas diarreas y del síndrome urémico hemolítico, que puede afectar seriamente a los niños pequeños y a los ancianos.

·       Además de esta bacteria, suelen estar presentes otras altamente peligrosas para la salud (por ejemplo especies de los Géneros Salmonella,  Shigella, Leptospira, Campylobacter jejuni  y el Vibrio cholerae). Todas estas generan trastornos que van desde fiebre, debilidad, nauseas, retortijones, vómitos y calambres, hasta enfermedades entéricas y pulmonares graves (por ejemplo: diarreas, shigelosis, fiebre tifoidea, leptospirosis y cólera).

·       Estas aguas negras pueden servir a la transmisión de diversos virus (Adenovirus, Rotavirus, Enterovirus, Virus Norwalk), por ejemplo agentes causales de afecciones intestinales y el responsable de la poliomielitis y el de la hepatitis A.

·       Pueden encontrase asimismo hongos microscópicos, como por ejemplo Aspergillus. Cerca de veinte especies de este hongo son causantes de un grupo de enfermedades (denominadas aspergillosis) que afectan a los seres humanos y animales (peces, mamíferos, aves e insectos). Estas dolencias van desde cuadros de tipo alérgico (broncopulmonares y sinusitis), hasta infecciones generalizadas que ponen en riesgo la vida de las personas que sufren alteraciones del sistema inmunológico. Algunas especies de este hongo pueden contaminar granos y raciones almacenados,  produciendo  varios tipos de toxinas, cuya ingestión puede inducir efectos letales o cancerígenos, particularmente en animales.

·       También en las aguas cloacales pueden hallarse diversos parásitos intestinales, como protozoarios (ej.: Entamoeba, Cryptosporidium parvum, Balantidium coli  y Giardia lamblia), gusanos helmintos como nemátodos (Ascaris lumbricoides), Ancylostoma, Trichuris y huevos de tenias.

·       La ruta primaria de exposición a los múltiples organismos presentes en aguas negras, es el contacto mano-boca o la “ruta fecal-oral”, la cual puede ocurrir durante ingestión de alimentos o agua (contaminadas directamente por salpicadura, manipulación sin observar higiene adecuada de manos o utensilios, o indirectamente por agentes vectores, como por ejemplo las moscas), al fumar, o al tocarse el rostro con las manos o guantes contaminados. La inhalación de aerosoles conteniendo microorganismos es menos común, pero puede ser una vía importante de ingreso de estos organismos en determinadas situaciones. En el caso particular que tratamos aquí, el tránsito vehicular genera aerosoles y abundantes salpicaduras, que llegan directamente a las personas, animales, ropas, etc. y que además pueden transportarse por acción del viento hasta una distancia considerable. Si bien la absorción de éstos microorganismos a través de la piel es poco probable, puede darse cuando ésta se encuentra dañada previamente (sea por cortes, raspones, pinchazos, quemaduras o herida de otro tipo). Las membranas mucosas (en nariz y ojos) también proveen una vía de entrada más a los organismos patógenos.

·       Finalmente, en esta agua suelen existir otros elementos contaminantes como por ejemplo hidrocarburos como el diclorobenceno (provenientes de las pastillas desodorantes de inodoros) y alquil-benceno (provenientes de los detergentes biodegradables), y eventualmente hasta desechos origen industrial, cuya presencia y concentración varían considerablemente, de acuerdo a la época del año y a la existencia o no de conexiones clandestinas a la red cloacal.

 

Para el ambiente:

 

·       Muchos de los agentes etiológicos antes mencionados pueden afectar no solamente la salud humana, sino también la de animales domésticos y silvestres.

·       Las aguas servidas que circulan por las calles pueden llegar hasta algún curso de agua (en nuestro caso el río Suquía). De esta forma aportan, por un lado, los agentes infecciosos ya mencionados que contaminan el agua volviéndola no apta para el consumo y el baño, y por el otro, llevan cantidades importantes de materia orgánica, fósforo y nitrógeno, que a su vez producen eutrofización (crecimiento desmedido de algas, diatomeas y plantas acuáticas) en zonas en que el agua tiene circulación lenta. Este proceso, a su vez, desencadena el crecimiento acelerado de bacterias aeróbicas que utilizan cantidades crecientes de Oxígeno para degradar la materia orgánica presente. Como consecuencia de ello, decrece la concentración de oxígeno disuelto en el agua y se produce la mortalidad de las especies de la fauna acuática que son menos tolerantes a bajos niveles de este elemento.

·       Por otra parte, la persistencia de estos líquidos en las zonas más bajas, que permanecen anegadas, produce la contaminación de los suelos y de las napas de agua subsuperficiales, tornándolas no aptas para higienización y consumo humano.

 

 Otros riesgos:

 

·       Si las zonas afectadas poseen suelos inestables, de naturaleza erosionable o potencialmente colapsable, la presencia constante de estos líquidos puede generar hundimientos en el terreno, e incluso amenazar estructuras al descalzar fundaciones y afectar estética y estructuralmente viviendas y otras construcciones humanas.

·       Asimismo, las calles de tierra o consolidadas y particularmente los pavimentos, se deterioran muy rápidamente por la acción combinada de la presencia frecuente o permanente de líquido y el tránsito vehicular intenso.

·       Por sus características, estas aguas además de ser riesgosas para la salud, tienen olor y aspecto desagradable. Esto genera rechazo y una mala imagen, por lo que las zonas afectadas tienden a ser evitadas por los mismos pobladores y los turistas, desencadenando así impactos negativos indirectos en la valorización de las propiedades y en la actividad económica a escala zonal.

·       Finalmente, debe considerarse que todo lo antes mencionado tiene un Impacto económico, ya que genera mayores costos para mitigar o remediar los impactos negativos ambientales, sanitarios, edilicios, comerciales y turísticos (Navarro, 2006).

 

 

Objetivos   

La presencia de Escherichia coli es indicadora de contaminación fecal reciente, dado que suele morir en no más de 24 hs. fuera del intestino. Este es un dato que fue fundamental para llevar a cabo nuestro objetivo el cual consistió en:           

Lograr, mediante análisis microbiológicos, la identificación de organismos patógenos producto de contaminación fecal que puedan ocasionar enfermedades en los seres vivos que rodean a la laguna y que además sean indicadoras de aportes de nutrientes que incrementen el proceso de eutrofización de la laguna. 

 

Hipótesis

De acuerdo al medio encontrado en la Laguna del Parque Sarmiento producto de la contaminación, habitan allí bacterias que son producto de la contaminación fecal y causantes de enfermedades patógenas. Esta hipótesis, por medio de los resultados obtenidos, la hemos podido comprobar y establecer como válida.

  

Materiales y Métodos

      Los métodos utilizados fueron los siguientes:

Primero se realizó una toma de muestras del medio de crecimiento de las bacterias, midiendo la temperatura y el pH como parámetros principales.

Los puntos de muestreo fueron:

Nº 1: 20 metros al Norte de la boca de desagüe de la laguna, en el rincón Sureste.

Nº 2: Sur de la laguna, en la desembocadura del desagüe de la calle Wenceslao Paunero.

Nº 3: Sur de la laguna, 10 metros al Oeste del busto de Crisol.

Nº 4: Oeste de la laguna, 20 metros al Sur del puente hacia la Isla Encantada, junto a un desagüe, próximo al tronco de un Eucalipto derribado sobre la laguna.

Nº 5: Noroeste de la laguna, 10 metros al Este del puente hacia la Isla Encantada, junto a un desagüe y un ciprés calvo.

Nº 6: Norte de la laguna, al terminar el embarcadero de botes, 15 metros al Este del kiosco que alquila los botes.

Se recogió el agua en frascos estériles de vidrio o plástico químicamente resistentes. No se precisó conservantes especiales al momento de almacenar la muestra.

Posteriormente se realizó una representación del medio de cultivos: selectivo, diferenciado, común, con el fin de identificar distintos tipos de microorganismos, y luego un acondicionamiento del medio de cultivo para lograr la proliferación; todo utilizando la técnica de asépticas de cultivo.

Técnica aséptica de cultivo:

§         Se utilizó, en lo posible, ropa blanca que protegiera la totalidad del cuerpo, bien sea;   bata o chaquetilla.

§         En el caso de presentar cabello largo se utilizó cofia.

§         En todo momento se procuró el empleo de barbijos, para evitar la propia contaminación de la muestra.

§         Se empleó gafas  en caso de ser necesario (esterilización de los medios de cultivo).

§         Se trabajó bajo la técnica aséptica: manteniendo encendido siempre un mechero en las cercanías del lugar de trabajo para esterilizar la zona de trabajo en un diámetro de 15 a 20 cm., alrededor, flameando el ansa metálica cada vez que se utilizó o se hicieron trasvases de sustancias de un origen a destinos diversos o viceversa.

§         Se rotularon las soluciones en todo momento con nombre.

§         Todas las superficies de trabajo fueron esterilizadas antes de comenzar la actividad  mediante el empleo de una solución de Alcohol 70%.

§         En todo momento se esterilizaron materiales, superficies, antes y después de trabajar, etc., con solución alcohol 70%.

§         Una vez preparados lo cultivos, y luego se su análisis, estos fueron inactivados, sumergiendo el medio de cultivo en una solución con formol.

§         Los recipientes que contuvieron el medio de cultivo, debieron lavarse y esterilizarse con la solución de alcohol al 70% y en estufa a 120º C antes de ser empleados nuevamente.

Una vez conseguido este objetivo se realizó extracción de colonias una vez identificado el microorganismo. Se aplicaron técnicas de tinción de acuerdo con las características del microorganismo (método de tinción de Gram) y se realizó la observación microscópica de los mismos para su identificación total, mediante el protocolo de identificación.

Requerimientos para la tinción:

1. Solución violeta: solución acuosa de cristal violeta 5g/l. Esta solución  es estable a temperatura ambiente.

2. Solución concentrada de Lugol: La solución esta constituida por yodo, 50g/l, y yoduro de potasio 100g/l. El recipiente debe mantenerse bien cerrado. Es estable a temperatura ambiente.

3. Solución decolorante: Etanol o alcohol etílico, el envase debe mantenerse bien cerrado. Es estable a temperatura ambiente.

4. Solución de Safranina: Solución acuosa de Safranina, conteniendo 12.8g/l, solución estable a temperatura ambiente.

Procedimiento:

     Se realizó el extendido sobre un portaobjetos limpio y desengrasado. La fijación se realizó pasando sobre la llama del mechero, tres o cuatro veces, la superficie del portaobjetos opuesta  a la que contiene el extendido, evitando el sobrecalentamiento (60 º C).

     El portaobjetos, se colocó sobre una fuente, con dos varillas de vidrio alineadas paralelamente como soporte del portaobjetos.

1. Se cubrió el preparado, previamente fijado, con la solución violeta, durante 1 minuto.

2. Se lavó con agua.

3. Se cubrió el porta con la solución de Lugol (diluida) durante 1 a 2 minutos.

4. Se lavó con solución decolorante (etanol) durante 5 segundos.

5. Nuevamente se lavó con agua.

6. Se cubrió con la solución de Safranina durante 30 a 40 segundos.

7. Se lavó con agua y secó.

Posteriormente se procedió al análisis de los microorganismos identificados realizando medios de cultivo para el análisis de coliformes totales y fecales.

Las bacterias coliformes son aquellas bacterias de morfología bacilar. Gram (-), aerobias o anaerobias facultativas, oxidasa negativas, no esporógenas, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 37 º C en un tiempo máximo de 48 hs.

Este grupo comprende los géneros Escherichia, Citrobacter, Kebsiella y Enterobacter, pertenecientes a la familia Enterobacteriáceas.

Interferencias:

Para evitar la contaminación por microorganismo aéreos se esterilizó el material en autoclave (elementos que vayan a entrar en contacto con el medio) a 121 º C durante 20 minutos.

Una vez concluida la identificación y análisis de todos los microorganismos presentes en las muestras, que incluía el conteo de unidades formadoras de colonias proliferadas en cada placa de petri, se elaboraron las conclusiones correspondientes para realizar a posterior un dictamen de resolución de problemas a las condiciones que favorecen la proliferación de bacterias patógenas y se elaborarán posibles soluciones para que no suceda.


Resultados

Las tablas muestran los resultados obtenidos para los seis puntos de monitoreo para las muestras tomadas el 7/11/08.

 

 

Tabla I. Medio de cultivo: Agar Levine (lectura realizada a las 36 hs.).

 

COLIFORMES TOTALES  (1 ml.)

 

FECHA

 Punto 1

Punto 2

Punto 3

Punto 4

Punto 5

Punto 6

7/11/08

54

ufc/ml

78

 ufc/ml

215 ufc/ml

100 ufc/ml

224

ufc/ml

450

ufc/ml

 

 

 

 

 

 

 

 

Tabla II. Medio de cultivo: Agar Levine. (Lectura realizada a las 24 hs).

 

Escherichia coli  (1 ml.)

 

FECHA

Punto 1

Punto 2

Punto 3

Punto 4

Punto 5

Punto 6

12/11/08

10

ufc/ml.

3

 ufc/ml

8

 ufc/ml

6

 ufc/ml

11

ufc/ml

+100

ufc/ml

 

 

 

 

 

 

 

 

Tabla III. Medio de cultivo: Chapman (manitol - sal) (Lectura realizada a las 36 hs.)

Staphylococcus

 

FECHA

Punto 1

Punto 2

Punto 3

Punto 4

Punto 5

Punto 6

07/11/08

68

ufc/ml

76

  ufc/ml

106

  ufc/ml

172

  ufc/ml

170

ufc/ml

0 

ufc/ml

 

 

 

 

 

 

 

 

Tabla IV. Medio de cultivo: Sabouraud

HONGOS (MOHOS-LEVADURAS)

 

FECHA

Punto 1

Punto 2

Punto 3

Punto 4

Punto 5

Punto 6

7/11/08

78

ufc/ml

82

ufc/ml  

42

  ufc/ml

28

ufc/ml  

6

ufc/ml

12

ufc/ml

 

 

 

 

 

 

 

Conclusión:

La Laguna del Parque Sarmiento presentó altos valores de unidades bacterianas formadoras de colonias, incluyendo Escherichia coli, como indicadora contaminación fecal reciente en este medio, además de otros microorganismos en valores muy elevados.

Según los parámetros de la Dirección Provincial de Agua y Saneamiento, para coliformes totales, lo permitido es hasta 5.000 bacterias por 100 mililitros de agua, que según las equivalencias serían 50 bacterias por 1 mililitro de agua. Teniendo como parámetro estos datos y comparando con los resultados obtenidos, es más que evidente que tratamos con un alto índice de contaminación fecal, que excede ampliamente los valores permitidos, ya que todos superan las 50 ufc/ml establecidas para coliformes totales. Para coliformes totales, el valor más alto fue de 450 ufc por mililitro, 90 veces más lo permitido.

Para Escherichia coli, el más alto valor obtenido fue de + 100 ufc por mililitro de agua, cuando no deberían registrarse más de 1,26 a 2 ufc por mililitro, lo que arroja niveles más de 50 superiores a lo permitido. Esto deja en claro, la magnitud de contaminación  que presenta la Laguna del Parque Sarmiento y que se deberán tomar medidas para disminuir estas cifras.

 

Bibliografía

Dirección Provincial de Agua y Saneamiento (DiPAS). Decreto 415/99. Desarrollo sostenible 2006.

http://www.dsostenible.com.ar/leyes/anexdec415cord.html

http://www.dsostenible.com.ar/leyes/dec415cord.html

Di Tofino, Exequiel. 2008. Jóvenes hacia el futuro (apunte de prácticos de Química). Instituto Nuestra Señora del Sagrado Corazón. Córdoba, Argentina.

Navarro, Joaquín. 2006. Riesgos en la salud y el ambiente derivados del desborde de líquidos cloacales en las calles de Córdoba. Foro Ambiental Córdoba. 

http://ar.oocities.com/foroambientalcba/cloacas.html 

Subsecretaria de Recursos Hídricos de la Nación. Diciembre 2003. Desarrollos de niveles guías nacionales de calidad de agua ambiente correspondientes a Escherichia coli/enterococos. República Argentina. www.hidricosargentina.gov.ar/pdfs/escherichia.pdf

Traductor Google. 2008

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