Huérfano a una temprana edad, Peter Parker (Tobey Maguire) vivió en Queens, Nueva York, con su querida Tía May (Rosemary Harris) y su Tío Ben (Cliff Robertson). Peter lleva la vida de un estudiante cualquiera, trabajando como fotógrafo del Daily Bugle bajo la tutela del editor J. Jonah Jameson (J.K. Simmons), suspirando por la bella Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) y pasándola bien con su colega Harry Osborn (James Franco).

En una excursión, en la que Peter y sus compañeros de clase asisten a una demostración científica con arañas, Peter es mordido por una de ellas, que ha sido manipulada genéticamente. Poco después, descubre que posee unos poderes poco habituales: ha sido dotado de la fuerza y agilidad de una araña así como de un agudo "sentido arácnido". Tras descubrir dichos poderes, Peter aparece en un combate de lucha televisado, armado con su nueva fuerza de araña, y gana en un tiempo récord. Pero el promotor del combate se niega a entregar a Peter el premio de 3.000 dólares que le corresponde, alegando que había ganado con demasiada rapidez. Poco después, Peter tiene la oportunidad de atrapar a un ladrón que se escapa de la oficina del promotor, pero como quiere venganza, decide no detenerlo. Unos momentos más tarde, el mismo ladrón asesina a su amado Tío Ben.

Como Spider-Man, Peter captura al delincuente, pero le atormenta la idea de no haberse convertido en un héroe antes. En ese momento de confusión, Peter recuerda algo que su Tío Ben le dijo en una ocasión: "El gran poder implica una gran responsabilidad". A Peter la frase le llega al alma y decide utilizar sus extraordinarios poderes para luchar contra el crimen.

Mientras tanto, el megalomaníaco hombre de negocios Norman Osborn (Willem Dafoe), el padre de Harry, está sufriendo algunos cambios en su ser. Una fórmula experimental ha explotado en su cara, aumentando su inteligencia y su fuerza, pero también trasformándolo en un demente. Ahora es el Green Goblin, el mayor enemigo del Spider-Man, quien pondrá a prueba la promesa del joven Peter Parker de ayudar a los inocentes y luchar contra el crimen.