O desenvolvimento da ciência, como um todo, tem levado o Homem a criar novas técnicas, que servirão de ferramentas para a melhoria de sua vida e manutenção da ecologia.

Nos últimos 50 anos, a biotecnologia vem se aprimorando para suprir as novas necessidades de produção. Como exemplo disso, temos: a congelação de sêmen, a Inseminação Artificial, a Superovulação, a Transferência de Embriões, a Fertilização in vitro e a Sexagem de Embriões e Espermatozóides, que aumentaram a eficiência reprodutiva e aceleraram o ganho genético dos animais de produção.

Outra possibilidade de novo avanço, é a manipulação do material genético (identificação e seleção de genes associados a características específicas), alterando a linha germinativa e produzindo clones que serão utilizados em programas de cruzamentos tradicionais (CAMPBELL & WILMUT, 1997).

Uma metodologia em desenvolvimento é o uso das Embryonic Stem Cells (ES-cells), cujos estudos iniciaram na década de 80 com MARTIN (1981), que definiu dois tipos de células tronco embrionárias: um originário de teratocarcinomas embrionários (EC-cells) e outro, de ES-cells.

As ES-cells são células pluri ou totipotentes, oriundas de embriões em estádios iniciais de desenvolvimento, que têm aplicabilidade tanto para a biologia básica (estudo da embriogênese e diferenciação celular) como para a aplicada (produção de clones, de animais quiméricos e trangênicos).

No entanto, a obtenção, manutenção e caracterização das ES-cells está bem definida somente em murinos, relativamente definida em ratos, hamsters, leporinos, mustelídeos e primatas, porém, indefinida em suínos, bovinos, ovinos e caprinos.

Uma das maiores dificuldades encontradas é a manutenção da indiferenciação celular, o que é obtida nas linhas ES-cells de camundongo com a adição do Fator Inibidor de Leucemia (LIF) recombinante murino e/ou LIF recombinante humano, que funciona parcialmente ou não na maioria das espécies, principalmente a bovina.

A precisa manipulação genética de vacas é de grande interesse econômico, devida à possibilidade de afetar positivamente a taxa de crescimento, composição corporal, resistência à doenças e criação de bioreatores para a produção farmacêutica (WILMUT et al., 1991).

Com o crescente interesse pela produção de animais domésticos geneticamente modificados, e pela maior eficiência na transmissão e expressão gênica, observada com a técnica de homólogos recombinantes e facilmente obtida com linhas ES-cells murinas, faz-se necessários esforços para a obtenção, manutenção e caracterização de linhas ES-cells nos animais domésticos, principalmente nos bovinos.

Uma das metodologias que vem crescendo, e com grandes perspectivas para o futuro, é a transfecção de linhas celulares e posterior utilização destas na produção de animais quiméricos ou clones trangênicos.

Tem-se como marco inicial dos estudos com ES-cells o trabalho de MARTIN (1981) que definiu dois diferentes tipos celulares em murinos: um originário de teratocarcinoma embrionário (EC-cells) e outro, de células tronco embrionárias (ES-cells) propriamente dita.

Inicialmente, dois métodos foram descritos para a obtenção de linhas ES-cells em camundongo. No estudo de MARTIN (1981) obteve ES-cells da massa celular interna (MCI) de blastocisto, seguido do seu cultivo em meio condicionado com EC-cells. Já na pesquisa de EVANS & KAUFMAN (1981) permitiu-se que blastocisto intactos desenvolvessem in vitro até alcançarem o estádio equivalente ao embrião pós-implantação inicial, os quais foram fragmentados e dispersos em tripsina e passados para placas de Petri contendo uma monocamada de fibroblasto murino imortalizado (STO), inativadas com Mitomicina C (STO-i), e meio não condicionado. As colônias celulares em crescimento apresentaram características semelhantes às EC-cells, mas mantiveram seu cariótipo normal.

Após estes estudos iniciais, a metodologia vem sofrendo alterações em busca de uma facilidade na obtenção destas linhas celulares.

Em 1984, AXELROD (1984) descreveu o estabelecimento de linhas ES-cells murinas obtidas diretamente de embriões pré-implantação, sem o uso de meio condicionado, imunocirurgia ou ovariectomia. Já em 1989, EISTETTER (1989) mostrou ser possível o isolamento de linhas ES-cells de camundongo utilizando mórulas no estádio de 16 a 20 células, possuindo características homólogas às ES-cells isoladas convencionalmente. Verificou também a facilidade e a maior eficiência da obtenção de linhas ES-cells de mórulas (37%) que de MCI de blastocistos (8%).

Toda metodologia utilizada para o isolamento de linhas ES-cells de espécies diferentes do camundongo, está baseada ou adaptada dos métodos originais usados para murinos.

O desenvolvimento de um sistema de cultivo de ES-cells depende da sua identificação e isolamento, da habilidade de cultivar, repicar e inibir a diferenciação celular, da demonstração da pluripotência pela remoção da inibição da diferenciação, e da demonstração da totipotência, como evidenciado pelo nascimento de quimeras de ES-cells ou de fetos de linhas ES-cells (FIRST et al., 1994).

A primeira tentativa de se isolar linhas ES-cells de bovino foi em 1990, quando EVANS et al. (1990) somente conseguiram isolar e manter linhas ES-cells de suíno, observando uma menor taxa de proliferação celular, quando comparada com a de murino, provavelmente refletindo a principal diferença no desenvolvimento pré-implantação nestas espécies, que é o período quiescente da MCI nos ungulados para a gastrulação.

Somente em 1992 foi reportada pela primeira vez por SAITO et al. (1992), o isolamento de células com morfologia semelhante à ES-cells (ES-like) de blastocisto e, seu potencial para a transferência nuclear. No entanto, as duas linhas celulares obtidas foram perdidas no quarto repique.

Posteriormente, VAN STEKELENBURG-HAMERS et al. (1995) reportaram que as linhas celulares bovinas obtidas, derivadas da MCI de blastocisto, assemelham-se mais com células epiteliais que células tronco totipotentes, apesar de serem hábeis em suportar o desenvolvimento inicial de oócitos enucleados reconstituídos.

Como antes provado para camundongo (EISTETTER, 1989), ficou demonstrado que colônias iniciais de ES-cells de bovino também podem ser obtidas de embriões no estádio de mórula, assim como serem viáveis para a transferência nuclear (STRELCHENKO & STICE, 1994).

A influência dos tipos de monocamada foi testada e evidenciada uma melhora no isolamento e desenvolvimento de linhas ES-like bovinas com o uso de células STO em detrimento às células epiteliais do útero bovino (VAN STEKELENBURG-HAMERS et al., 1995).

O meio é geralmente tamponado com bicarbonato, mas deve ser incubado em atmosfera a 5% de CO₂ em ar para manter o pH ao redor do neutro; quando tamponado com Hepes, não necessita ser incubado em CO₂.

As condições para as ES-cells de camundongo estão bem definidas (ROBERTSON, 1987), mas a principal fonte de indutores da diferenciação na cultura de ES-cells é o soro fetal bovino (SFB) (GOLDSBOROUGH et al., 1998). Tenta-se eliminar os fatores de diferenciação celular do SFB pelo uso do charcol (VAN STEKELENBURG-HAMERS et al., 1995) ou substituí-lo completamente.

O charcol remove substâncias lipofílicas do SFB, incluindo-se os retinóides (ácido retinóico), que induzem a diferenciação celular em ES-cells de camundongo. Apesar disso, VAN STEKELENBURG-HAMERS et al. (1995) observaram somente um aumento na taxa de isolamento e na eficiência dos repiques mas não uma diferença na morfologia e nas características do desenvolvimento celular, usando meio contendo SFB adsorvido com charcol. Isto deixa em dúvida a real função destes retinóides no soro fetal para as células bovinas.

Com o objetivo de se eliminar o SFB, GOLDSBOROUGH et al. (1998) verificaram a eficiência de um suplemento definido livre de soro, Knockout^TM substituto do soro (SR), para manter uma maior porcentagem de colônias ES-cells murinas na forma indiferenciada na ausência do LIF, com relação ao controle (uso de SFB como suplemento), sem que houvesse interferência na taxa de crescimento celular. Esta eficiência foi aumentada quando utilizou-se o meio Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (Knockout D-MEM), uma formulação otimizada do meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).

WILLIAMS et al. (1988), observando a similaridade estrutural e funcional do DIA com o LIF, um regulador hematopoiético e primeira proteína identificada que influencia a diferenciação das ES-cells murinas (STEWART, 1994), verificaram a possibilidade do uso do LIF recombinante murino na manutenção da indiferenciação de linhas ES-cells murinas, determinando sua concentração ótima em 1.000UI/ml. Também foi demonstrada a pluripotência das ES-cells mantidas com LIF, suportando a proposição de que DIA ou LIF é um fator regulatório importante no desenvolvimento embrionário normal de camundongos.

O LIF é secretado por uma variedade de tecidos adultos e em diferentes estádios do desenvolvimento fetal, mas geralmente em baixos níveis, com exceção do intestino delgado e pele (fibroblasto primário) de camundongos recém-nascidos. No entanto, níveis elevados de LIF estão presentes nas glândulas endometriais de úteros com quatro a cinco dias de gestação, período que coincide com a implantação do blastocisto, sugerindo uma função regulatória deste processo. Esta expressão está sobre controle materno, independente da presença de embriões viáveis, sendo possivelmente uma resposta direta ao aumento das concentrações de estrógeno que ocorre neste período e, é essencial para a implantação (STEWART et al., 1992). Isto sugere que o LIF pode regular o crescimento e a implantação inicial do blastocisto (BHATT et al., 1991; SHEN & LEDER, 1992), tendo uma dupla ação na embriogênese inicial: como embriotrofina e como fator requerido para a implantação (LAVRANOS et al., 1995).

Portanto, a ação do LIF em manter ES-cells de camundongo na forma indiferenciada pode ser um reflexo de seu papel fisiológico durante a embriogênese. No entanto, o LIF não bloqueia todas as vias da diferenciação nos corpos embrióides, mas exerce um efeito seletivo, inibindo a formação do ectoderma primitivo enquanto permite a diferenciação do endoderma primitivo (SHEN & LEDER, 1992); conseqüentemente, fica inibida a formação do endoderma, ectoderma, mesoderma e células germinativas, originárias do ectoderma primitivo (MOORE & KEMLER, 1997).

Assim, os efeitos do LIF, sobre o embrião murino, podem ser primariamente controlar a proliferação celular no blastocisto peri-implantação e, em particular, na MCI, a qual, por sua vez, regula a proliferação do trofoblasto. Desta forma, as ES-cells podem ser consideradas como células da MCI que estão sobre um contínuo estímulo para proliferação, devida à presença do LIF no meio de cultura (STEWART, 1994).

Sabendo-se desta ação do DIA ou LIF sobre as ES-cells, NICHOLS et al. (1990) demonstraram ser possível o isolamento e a manutenção de linhas ES-cells murinas indiferenciadas na ausência de monocamada de FPFM-i, que dificulta a manipulação genética das ES-cells e a caracterização dos moduladores de diferenciação e crescimento específicos, usando somente meio suplementado com DIA ou LIF recombinante humano ou murino purificados. Além disso, foi demonstrada a manutenção de sua pluripotência, inclusive a transmissão para a linha germinativa.

Já em animais domésticos, o LIF recombinante murino não apresenta a mesma eficiência em inibir a diferenciação celular (PIEDRAHITA et al., 1990; STRELCHENKO, 1996). Isto provavelmente ocorre por estas células não apresentarem ou possuírem poucos receptores para o LIF, ou requererem um co-fator para responderem a ele, ou os receptores para LIF são espécie-específicos, somente reconhecendo o LIF homólogo (VAN STEKELENBURG-HAMERS et al., 1995).

O uso alternativo de LIF recombinante humano foi utilizado com relativa eficiência para suínos (WIANNY et al., 1997), mas foi pouco eficiente para bovinos (STRELCHENKO, 1996).

Em geral, a identificação de um particular tipo celular pode ser feita com critérios morfológicos e/ou bioquímicos, incluindo a microscopia eletrônica. Normalmente, a morfologia é bastante sugestiva do tipo celular, o que pode ser confirmado pela identificação de um ou mais componentes macromoleculares de distribuição restrita (ROBERTSON, 1987).

Muitos processos bioquímicos destroem a célula (como a eletroforese mono ou bidimensional em gel), sendo ideal o uso de técnicas que conservem a arquitetura celular (como o anticorpo monoclonal). As proteínas linhagem-específica mais usadas são as que compõem a malha dos filamentos intermediários, havendo cinco classes: neuro-filamentos (neurônios), proteína ácida fibrilar glial (astroglia), citoqueratina (células epiteliais), desmina (músculos) e vimentina (mesoderme). Uma vez determinada que classe a célula estudada pertence, pode-se usar marcadores mais restritos dentro da linhagem identificada. O uso de antígenos de superfície celular como marcadores também são valiosos na identificação do tipo celular, apesar de serem menos fidedignos que os antígenos intracelulares (ROBERTSON, 1987).

Um marcador de indiferenciação celular muito utilizado para ES-cells de murinos é a presença da atividade da Fosfatase Alcalina, mas não é considerado um bom marcador para as células de bovino (VAN STEKELENBURG-HAMERS et al., 1995). Porém, em outras espécies como suíno e ovino, pode ser usada associada à morfologia celular para indicar um estado de indiferenciação (TALBOT et al., 1995).

Assim como as EC-cells, as ES-cells são usadas na biologia básica como um modelo de estudo dos processos de desenvolvimento da diferenciação e acometimento celular embriônico inicial. Já na biotecnologia, seu uso se estende como um veículo para a transferência de alelos mutantes para o genoma animal (animais trangênicos), selecionados em cultura celular ou inseridos nas células via transformação com fragmentos específicos de DNA (EVANS & KAUFMAN, 1981).

Desta forma, podem ser intermediários para a produção de novas raças com genes mutantes ou exógenos pré-selecionados; para isso, estas células devem ser capazes de se desenvolverem normal e ordenadamente em embriões portadores e estarem presentes nas células germinativas (STEWART & MINTZ, 1981).

Um meio para forçar o desenvolvimento de fetos inteiramente com componentes de ES-cells em seus tecidos, é a combinação de embriões tetraplóides (desenvolvimento comprometido) com ES-cells (quimerismo), com capacidade de formar todas as linhagens fetais (pluripotência) e suportar o desenvolvimento fetal normal, embora tenha inicialmente falhado na sobrevivência após o nascimento. Apesar disso, esta metodologia serve para estudar o desenvolvimento de ES-cells geneticamente manipuladas em todas as linhagens fetais (NAGY et al., 1990).

No início, as EC-cells murinas foram usadas em estudos com manipulação genética, mas para esta finalidade têm uso limitado, devido a maioria das linhas celulares apresentarem anormalidade no cariótipo. Isto foi superado com o uso das ES-cells que apresentaram cariótipo euplóide (ROBERTSON, 1991).

Com as ES-cells de camundongo, obteve-se o acesso à linha germinativa funcional e a manipulação genética in vitro, por meio de técnicas para a introdução de DNA nas ES-cells (pela eletroporação por THOMAS & CAPECCHI (1988) ou, por ROBERTSON et al. (1986), pela infecção com vetores retrovirais), surgindo uma grande possibilidade da manipulação do genoma do camundongo em cultura. Isto abriu um vasto campo de estudos para a análise do desenvolvimento embrionário inicial, avaliando-se as diferenciações celulares e a ativação dos genes durante este período com a produção de animais mutagênicos. Esta alteração genética tem melhores resultados com a técnica da recombinação homóloga, onde as células ou animais carregam modificações genéticas extremamente precisas nos genes endógenos, podendo se constituir em camundongos modelos para o estudo de doenças genéticas da espécie humana (ROBERTSON, 1991).

As quimeras de ES-cells foram produzidas pela injeção dentro de blastocistos, mas apresentavam baixa eficiência (20%). Com a sugestão de NAGY et al. (1990) de que a injeção ou agregação com mórulas era mais eficiente, foi alcançada uma eficiência de 80% na produção de quimeras com a injeção de ES-cells de camundongo dentro do espaço peri-vitelíneo de embriões de 8 células, apresentando alta habilidade em produzir células germinativas funcionais (TOKUNAGA & TSUNODA, 1992). Esta técnica foi melhorada por WOOD et al. (1993b), que produziram quimeras com o simples cultivo de mórulas de oito células, sem a zona pelúcida, sobre as ES-cells, facilitando e reduzindo o tempo de manipulação (WOOD et al., 1993a).

Embora as ES-cells sejam usadas para a produção de trangênicos, leva um longo tempo para a obtenção de animais trangênicos homólogos; este período pode ser reduzido com a técnica de reconstituição nuclear de oócitos murinos com ES-cells, realizado por TSUNODA & KATO (1993), mas não tiveram desenvolvimento fetal. Em contraste a isto, tem-se que o núcleo de embriões pré-implantação de bovino suporta o desenvolvimento de oócito enucleado a termo (KEEFER et al., 1994).

Muitos são os trabalhos utilizando-se animais trangênicos e ES-cells para o estudo da expressão gênica, interações célula-célula e função do gene. Com esta ferramenta, podem ser criados modelos de doenças, expressão gênica na oncogênese, sua regulação hormonal e seu desenvolvimento, análise das linhagens celulares e terapia genética (revisado por CAMPER et al., 1995).

Uma preocupação deve haver com relação a manutenção da euploidia nas linhas celulares, pois já demonstrou-se que estas são afetadas pelo avançar dos repiques com anormalidades no seu cariótipo (STRELCHENKO et al., 1995).

As linhas fêmeas têm sido produzidas e usadas para estudo in vitro e produção de quimeras (NICHOLS et al., 1990). No entanto, a possibilidade de formar linhas quimeras com células da linha germinativa derivadas de ES-cells fêmea, só foram obtidas por VOSS et al. (1997), mostrando também que foi capaz de converter o sexo do embrião hospedeiro macho.

As ES-cells de murinos, leporinos, hamsters e ratos, rotineiramente são obtidas e mantidas com a suplementação do LIF recombinante murino (ROBERTSON, 1987; DU et al., 1995; OUHIBI et al., 1995). Para as espécies mamíferas de maior interesse econômico (bovino, ovino e suíno) este mesmo inibidor de diferenciação não mostrou ser eficiente (PIEDRAHITA et al., 1990; STRELCHENKO, 1996). O uso alternativo do LIF recombinante humano foi utilizado com relativa eficiência para suínos (WIANNY et al. 1997) e pouco eficiente para bovinos (STRELCHENKO, 1996).

Os métodos alternativos para melhorar a eficiência na obtenção e na manutenção da indiferenciação foram propostos com o uso de células BRL ou o meio condicionado com elas, bem como, o tratamento do SFB com "charcol" para remoção dos esteróides (VAN STEKELENBERG-HAMERS et al., 1995). Os fibroblastos STO e fibroblastos primários fetais ovinos (FPFO) foram mais eficientes como monocamadas de sustentação para a fixação das células embrionárias bovinas (VAN STEKELENBERG-HAMERS et al., 1995; REXROAD & POWELL, 1997). Porém, a manutenção com a caracterização da indiferenciação vem constituindo um dos principais problemas de obtenção das ES-cells bovina (VAN STEKELENBERG-HAMERS et al., 1995). Isto motiva inúmeros pesquisadores a vencer estas barreiras, pela importância que esta biotecnologia representa na mais nova concepção da produção de animais geneticamente modificados.

Quando esta biotecnologia se tornar realidade para as espécies domésticas, um grande salto estará sendo dado para a otimização da produção alimentar e farmacêutica.

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