A Membrana de Espermatozóides e sua Relação com o Potencial de Desempenho Reprodutivo do Macho Marcelo Roncoletta doutorando em Medicina Veterinária, Área de Concentração: Reprodução Animal Departamento de Reprodução Animal - FCAVJ - UNESP

Este é um capítulo extremamente interessante, já que o espermatozóide é uma célula diferenciada, extremamente especializada, com várias funções e que vive em diferentes meios (trato genital masculino e feminino).

Alguns aspectos sobre estrutura e função de membranas biológicas estão detalhados em ESTRUTURA E FUNÇÃO DE BIOMEMBRANAS. Sabe-se que a função de membrana está intimamente relacionada com composição protéica de membrana, e que está é conseqüência direta do código genético do indivíduo e da especialização do tecido.

Interessantemente, SHABANOVITZ & KILLIAN (1987) e MYLES et al. (1990), demonstraram que o espermatozóide não possui capacidade de síntese protéica. Considerando os estágios de diferenciação celular durante a espermatogênese, tal propriedade ocorre até a fase de espermátide.

Considerando as várias funções de um espermatozóide para cumprir seu papel primordial que é a fertilização, ele deve sobreviver em meios bastante adversos e alheios ao seu meio onde foi formado que são os túbulos seminíferos, considerando aqui a fisologia da fertilização que é dependente do genital do macho e da fêmea.

Atualmente sabe-se que o espermatozóide lança mão de mecanismos alternativos para manutenção de sua viabilidade frente aos processos testiculares e posteriores a esta orgão. São eles a maturação epididimária a interação espermatozóide com o plasma seminal na ejaculação, na capacitação e reação acrossomal no trato genital feminino, na fertilização (fusão de membranas) e atualmente ainda, não devemos desconsiderar a interação com diluidores de sêmen e o comportamento dos espermatozóides frente aos processos de criopreservação e descongelação, já são processos que diminuem a heterogenicidade de membrana, e consequentemente sua fluidez fica prejudicada, tornando-se as vezes, inapta após o processamento.

O termo heterogenicidade de membrana vem sendo utilizado para denominar grau de diferenciação estrutural de membrana. Considera-se que quanto maior o grau de heterogenicidade de membrana de uma célula, mais apta esta a célula para sobreviver em diferentes condições e/ou meios.

Os mecanismos alternativos utilizados pelo espermatozóide podem ser resumidos em distribuição lipídica e adsorção ou deleção de proteínas e consequente interação destas com as já existentes na membrana do espermatozóide.

As conseqüências diretas de tais mecanismos são a alteração da fluidez de membranas (permeabilidade e estabilidade), alteração da heterogenicidade de membrana e também da compartimentalização e domínios de membrana. Indiretamente á alterações nas funções celulares, na integridade de membrana, diminuição e aumento de resistência a choque e alterações de temperatura e na fertilidade e fecundidade do espermatozóide.

Em suma, todos esses processos que ocorrem com o espermatozóide pós-testículo, são considerados fatores de interferência na fertilidade do mesmo. A variação dos padrões de fertilidade individuais nos machos é assunto que vem intrigando muitos pesquisadores, visto que são vários os fatores que podem contribuir para esta variabilidade. BACCETTI et al. (1979); MORGENTALER et al. (1990); MARCHINI et al. (1990); AUTIERO et al. (1991); WOLFE et al. (1993) e FRAZER et al. (1996) utilizaram-se da técnica de eletroforese para mapear e identificar componentes proteícos solúveis nos ejaculados de diferentes espécies, buscando alguma relação com fertilidade masculina e indicaram possíveis marcadores bioquímicos, presentes no líquido seminal para mensurar a fertilidade.

COOPER (1998), NAABY-HANSEN et al. (1997), WOLF et al. (1992), MYLES et al. (1990) SHABANOWITZ & KILLIAN (1987), RUSSEL et al. (1984),MILLETTE et al. (1980) e VIURELLA & RAJANIEMI (1980) estudaram modificações na composição de polipeptídeos de membrana de espermatozóides durante o transito epididimário, na reação acrossomal e fertilização, correlacionando tais modificações a fertilidade.

OLLERO et al. (1998) verificaram que há perda de 04 bandas (35, 68, 100 e 245KDa) no sêmen congelado quando comparado ao fresco, e afirmaram que esta perda é devido a danos à membrana induzidos pelos processos de criopreservação e descongelação. OLLERO et al. (1997) afirmaram que esta perda de heterogenicidade na membrana, causada pela diluição e criopreservação do sêmen pode ser previnida com a remoção de moléculas com peso molecular menor que 10KDa do plasma seminal mantendo-se a heterogenicidade de membrana necessária para que esta seja viável para a criopreservação.

STEELE & WISHART (1996) afirmaram que espermatozóides de galos também sofrem perda de algumas proteínas quando são submetidos à criopreservação, principalmente em meios de alta osmolaridade, como é o caso dos meios de criopreservação com glicerol. Sugeriram que estas proteínas são associadas ou implantadas na membrana do espermatozóide durante o processo de maturação epididimária, onde as células entram em contato com o plasma seminal. De LEEUW et al. (1990) citaram vários fatores que podem influenciar no comportamento de membranas celulares frente a alterações de temperatura do meio e mencionaram, entre elas, a alta concentração de proteínas, que pode aumentar a estabilidade da membrana, diminuindo as chances de alterações induzidas pelo resfriamento. MUER et al. (1988) e MAXWELL et al. (1997) também citaram alterações bioquímicas na membrana do espermatozóide, como danos à integridade estrutural e funcional da célula durante os processos de criopreservação. THAKKAR et al. (1983) sugeriram que a fosfolipase A2 tem papel importante na fusão de membranas durante os eventos da fertilização, enquanto DICK & BUHR (1993) afirmaram que os processos convencionais de criopreservação diminuem a ação desta enzima em até 50%, e consequentemente, diminuem as reações na membrana plasmática do espermatozóide, reduzindo sua capacidade para a fertilização.

A maturação espermática pode ser resumida como um conjunto de fenômenos bioquímicos que ocorrem com a célula espermática, culminando com o potencial de motilidade da mesma. É dependente de uma seqüência de eventos que ocorrem após a exposição aos fluídos epididimários, alterando a membrana plasmática dos espermatozóides. Cabe lembrar, entretanto, que sendo o epidídimo composto por três porções (cabeça, corpo e cauda) em cada uma delas ocorrem eventos específicos.

Na cabeça do epidídimo ocorre uma concentração dos espermatozóides vindos do testículo, e inicia-se o processo de maturação propriamente dito, porém ainda funções independentes de andrógenos. Neste estágio, alterações e mudanças na composição e distribuição lipídica ocorrem com maior importância.

No corpo do epidídimo, começam as maiores alterações maturacionais dos espermatozóides, processos já dependentes de testosterona (dependentes de proteína adsorvida à membrana - ABP - androgen binding protein), como alteração e distribuição lipídica, adesão de proteínas que participarão da regulação da motilidade espermática, estabilização do acrossoma, capacidade de ligação à oócitos.

Na cauda do epidídimo as funções são dependentes de outros fatores reguladores, que não a testosterona, porém todas visando o estoque de espermatozóides com potencial de fertilização, ou seja manutenção da viabilidade do espermatozóide já maturado resguardando-o para uma possível ejaculação.

Talvez possamos extrapolar, mencionando que os eventos bioquímicos de alteração lipídica e glicolisação de proteínas sejam os mais frequentes durante a maturação epididimária, porém sem desconsiderarmos a importância das adesões e deleções de proteínas na membrana do espermatozóide durante estes processos. (Ver Figura 01).

O sêmen é composto por duas frações distintas: os espermatozóides, que compõe a menor fração e o plasma seminal (PS), produto de secreção das glândulas anexas do trato genital masculino. WITE (1988) sugere que o PS tem como principal função servir como meio de transporte e sustentação para os espermatozóides, porém este e outros autores colocam em dúvida a importância do mesmo no processo de fecundação.

A literatura nos mostra uma diversidade e uma dualidade no papel do PS, expondo vários fatores prós e vários contra a fertilidade dos espermatozóides. Na maioria, esses fatores são proteínas presentes no plasma seminal que se aderem à membrana espermática pós ejaculação. Cabe salientar, entretanto que determinadas condições podem afetar a composição protéica do PS e consequentemente a fertilidade dos espermatozóides que entrariam em contato com o mesmo. O intervalo entre ejaculações, o método de coleta de sêmen, a estação do ano, a idade e raça doas animais podem ser considerados fatores de variação para o concentração de proteínas presentes no PS.

Entretanto os trabalhos mais recentes tem fundamentando que alguns dos fatores considerados anti-fertilidade possuem tal função em determinado momento do metabolismo espermático, mas que posteriormente, no momento necessário podendo até auxiliar nos processos de fertilização.

Das divergências do papel do plasma seminal como agente de variação dos padrões de fertilidade nos machos, salientamos algumas delas. LINDHOLMER (1974) já mencionava fatores presentes no plasma seminal como prós e contras à fertilidade masculina em humanos. Alguns marcadores bioquímicos encontrados em plasma seminal são apontados para identificar animais superiores ou inferiores quanto ao seu potencial de fertilidade.

SIMPSON & HOLMES (1984) sugeriram associações de um dos compostos proteícos da membrana plasmática, denominado MCP (membrane cofactor protein), com o plasma seminal sugerindo papéis importantes nos processos de fertilização, conferindo proteção contra possíveis danos aos espermatozóides.

MILLER et al. (1990) mencionaram que a presença do plasma seminal é indispensável para a capacitação espermática e posterior fecundação, devido a presença de algumas proteínas denominadas de HPB (heparin- binding proteins) que são produzidas pelas glândulas acessórias masculinas, excretadas no líquido seminal e ligadas à proteínas de membrana dos espermatozóides. BELIN et al. (1994) buscaram estabelecer a associação entre a fertilidade masculina, com a capacidade dos espermatozóides de realizar reação acrossomal (capacitação), frente a indução por HPBs, ou seja, quanto maior a afinidade da heparina (substituto das HPBs) na membrana dos espermatozóides, maior a fertilidade masculina.

ESCH et al. (1983); MANJUNATH & SAIRAN (1987) purificaram e caracterizaram as duas proteínas em maior quantidade no plasma seminal de bovinos, as quais são produzidas pelas vesículas seminais, denominadas BSP-A1 (16,5KDa), BSP-A2 (16KDa) que juntas podem ser chamadas de PDC-109, e a BSP-A3 (15KDa). Posteriormente, os mesmos autores incluíram a BSP-30KDa no mesmo grupo de proteínas.

DESNOYERS & MANJUNATH (1992) demonstraram que as BSPs são proteínas com capacidade de ligação a fosfolipídeos, lipoproteínas (HDLs do trato reprodutor feminino) e heparina, podendo assim se ligar a membrana plasmática do espermatozóide, no ato da ejaculação. MANJUNATH et al. (1993b) levantou três hipóteses como funções das BSPs no metabolismo espermático, a primeira que serviriam como decapacitantes, evitando uma reação acrossomal precoce, devido a capacidade de interação destas proteínas com os fosfolipídeos de membrana e não diretamente com os HDLs no trato reprodutor feminino; a segunda , mediando a troca do colesterol e fosfolipídeos entre a membrana plasmática do espermatozóide e os HDLs presentes no trato reprodutor feminino, conferindo alteração na permeabilidade das membranas, facilitando a entrada de cálcio, por ativação da fosfolipase A e desencadeando a reação acrossomal; e ainda MANJUNATH et al. (1993 a) e DESNOYERS et al (1994) sugeriram que as BSPs serviriam como pontes de ligação entre membranas de espermatozóides e calmodulina, participando dos eventos regulatórios do transporte de cálcio durante a capacitação e reação acrossomal, , ou seja, a possibilidade destas BSPs não só agirem como decapacitantes, mas eventualmente podem agir como promotores de capacitação. RONCOLETTA (1999) sugeriu que a proteína de 14,4KDa também pode influenciar no metabolismo espermático condizente a criopreservação de espermatozóides.

KILLIAN et al. (1993), desenvolveram uma equação matemática para diferenciar a fertilidade de touros de acordo com o perfil protéico encontrado na eletroforese de plasma seminal, onde destacaram duas proteínas (55KDa pI 4,8 e 26 KDa pI 6,4) como marcadores de touros de alta fertilidade e duas proteínas (16 KDa pI 4,1 e 6,7) para touros de baixa fertilidade. KILLIAN (1992) mencionou que os touros de alta fertilidade possuem 8 vezes menos a concentração destas proteínas marcadoras de baixa fertilidade; 3,5 vezes mais a proteína de 26Kda e 2,6 vezes mais a proteína de 55KDa.

CANCEL et al. (1997), com o propósito de identificar essa proteína de 55 KDa, prevalente em touros de alta fertilidade, verificaram através do sequênciamento da cadeia de aminoácidos do N-terminal desta molécula, uma homologia de 86% com o precursor da osteopontina-k bovina. Com o uso de “western-blot” e anticorpo policlonal da osteopontina recombinante humana, confirmou-se que a proteína de 55KDa era uma osteopontina. GERENA et al. (1998), da mesma maneira trabalharam com a proteína de 26KDa e verificaram no sequênciamento do N-terminal, uma identidade de 76% e homologia em 100% desta com a lipocaina- tipo prostaglandina D sintetase, confirmando também com os resultados do “western-blot”, utilizando-se de anticorpo policlonal contra lipocaina tipo PGD sintetase isolada de cérebro de rato e fluído cérebro espinhal de humanos e por cDNA isolada por PCR reverso, obtendo identidade em 63-80%. Tais proteínas demonstraram atividade no plasma seminal, fluido de epidídimo e de testículo, porém apesar de identificarem animais de alta fertilidade, ainda não se sabe qual o papel destas proteínas na bioquímica espermática. RONCOLETTA (1999) sugeriu que estas proteínas podem influenciar na criopreservação espermática, porém necessitando de maiores estudos para confirmar a comparação entre a identidade destas proteínas com o encontrado na literatura.

BENTLEY et al. (1984), sugeriram que a maior concentração de determinada proteína no plasma seminal de galos poderia estar correlacionada com um melhor desempenho na capacidade de fertilização do sêmen congelado, indicando-a como um parâmetro para a seleção de reprodutores. DHAMI & KODAGALI (1986), associaram congelabilidade do sêmen de búfalos com concentração de proteínas totais, sólidos totais, frutose, e as enzimas glutamato- oxalacetato transaminase e glutamato - piruvato transaminase. PANGAWKAR et al. (1988) verificaram que a concentração de ácido siálico, elemento provavelmente relacionado com os processos de maturação de espermatozóide no epidídimo, não estão relacionados com congelabilidade do sêmen. Os níveis de zinco, quando em concentrações menores, a congelabilidade do sêmen era prejudicada, pois este elemento interfere na integridade de membrana dos espermatozóides. Também verificaram que a criopreservação do sêmen foi prejudicada pelo aumento da concentração de proteínas do plasma seminal.

AURICH et al. (1996) concluíram que a composição do plasma seminal afeta a susceptibilidade de criopreservação de espermatozóides equinos. A adição de plasma seminal de garanhões de baixa congelabilidade (motilidade inferior na descongelação) pode diminuir o parâmetro motilidade, porém sem induzir alterações na integridade de membrana, analisada através de microscopia de fluorescência.

Entretanto em algumas pesquisas realizadas, foram encontrados fatores negativos á fertilidade ou congelabilidade do sêmen, presentes no plasma seminal. MOORE & HIBBIT (1976) e MOUSTAFA & MESZAUROS (1980) postularam que as proteínas presentes no plasma seminal se ligam as proteínas de membrana dos espermatozóides provocando algumas alterações bioquímicas. Levantaram hipótese de que isso aumentaria a permeabilidade da membrana, promovendo injúria celular e choque térmico, durante a congelação. KATSKA et al. (1996) também citaram fatores anti-fertilidade no plasma seminal bovino que estabilizam a membrana plasmática e acrossomal do espermatozóide, impedindo a reação acrossomal e inibindo sua capacitação, nos processos de fertilização in vitro.

GARCIA & GRAHAN (1987) reportaram que uma fração protéica de baixo peso molecular (>12-14KDa) não é benéfica para as células espermáticas durante os processos de congelação, e demonstraram que a diálise, por duas horas a uma temperatura inicial de 37°C a 5°C, pode ser um método para a separação desta fração protéica, melhorando a congelabilidade do sêmen. AL-SOMAI et al. (1994a) afirmaram que o prejuízo à motilidade espermática causado por este grupo proteíco tem efeito dependente da concentração encontrada destas proteínas no plasma seminal. AL-SOMAI et al. (1994b) comentaram que as proteínas em maior concentração no plasma seminal, com peso molecular entre 15-16KDa, aniônicas, são maléficas a motilidade espermática, e que a sua retirada por diálise pode trazer melhora neste parâmetro. VAN VOORST & LEENSTRA (1994) demostraram que com sêmen de galo, a remoção de moléculas com pesos moleculares menores que 8 KDa do plasma seminal pode aumentar a capacidade de fertilização do sêmen resfriado; porém esta mesma técnica não tem efeito benéfico quando o sêmen é submetido a criopreservação.

Segundo BAAS et al. (1983), a porção do plasma seminal prejudicial aos espermatozóides bovinos é a fração de alto peso molecular, e de acordo com SCHMEHL et al. (1986), tais proteínas de alto peso molecular competem nos sítios de ligação na membrana plasmática dos espermatozóides, podendo bloquear os efeitos benéficos da gema de ovo utilizada no diluidor, para a criopreservação das células. Entretanto não somente a presença ou ausência dos fatores pre-determinariam a fertilidade do ejaculado durante a sua estadia na cauda do epidídimo para a maturação, mas também a concentração crítica destas proteínas podem ser responsáveis pelos efeitos do plasma seminal na fertilidade espermática. HENAULT & KILLIAN (1996), verificaram que quando presentes em meio contendo plasma seminal provindo de animais de alta fertilidade, os espermatozóides tem maior habilidade para penetrar nos óvulos em ensaios “in vitro”, quando comparados a meios com plasma seminal de animais de baixa fertilidade, sejam estes espermatozóides de animais de alta ou baixa fertilidade.

VIURELLA & RAJANIEMI (1980) sugeriram que as proteínas de membrana são semelhantes aquelas encontradas no plasma seminal, demonstrando que a interação destas proteínas parece ter papel significativo na capacidade de fertilização do espermatozóide. RONCOLETTA et al (1996) indicaram um polipeptídeo presente no perfil eletroforético de plasma seminal de touros zebuínos como possível marcador bioquímico para congelabilidade do sêmen, porém explicitou que os processos bioquímicos ocorridos durante a criopreservação do sêmen, parecem envolver os componentes proteícos tanto dos líquidos biológicos que participam do transporte e proteção dos espermatozóides, como também das proteínas de membrana destas células, dando importância a presença e/ou ausência e concentração crítica destas proteínas no plasma seminal e as interações dos componentes proteícos de plasma seminal com a membrana plasmática do espermatozóide.

Com relação as técnicas para estimativa da fertilidade de touros de raças zebuínas, principalmente da raça NELORE, o DMVPRA/Lagoa da Serra são pioneiros na utilização de marcadores protéicos para a fertilidade e congelabilidade do sêmen (RONCOLETTA, 1999), e na adaptação da técnica de indução da reação acrossomal para estas raças (RAMALHO et al., 1998).

Recentemente, tem-se utilizado para estimativa da fertilidade de touros, o perfil eletroforético bidimensional das proteínas de plasma seminal (KILLIAN et al., 1993), proteínas estas já isoladas e purificadas (CANCEL et al., 1997; GERENA et al. 1998), com identificação sugerida porém ainda sem muitas informações sobre suas funções no metabolismo espermático, e o modo como influencia nos índices de fertilidade dos machos.

Existem também outras proteínas em evidência, hoje denomindadas de BSPs (Bovine seminal plasma proteins), intensamente estudadas pelo grupo canadense dirigido por Manjunath, P. (MANJUNATH et al., 1993a,b; MANJUNATH & SAIRAM,1987, DESNOYERS & MANJUANTH,1992; DESNOYERS et al., 1994) já hipotetizando algumas funções destas proteínas no metabolismo espermático (LANE, M.E., 1999; THÉRIEN,I. et al., 1998; THÉRIEN,I. et al., 1997), como reorganização de membrana, através do fluxo ou movimentação de moléculas de colesterol na bicamada lipídica. Assim, tais funções podem além de influenciar durante os processos de capacitação espermática e reação acrossomal podem também interferir nos processos de criopreservação (RONCOLETTA et al. , 1999), influenciando assim, o padrão de desempenho reprodutivo de um indivíduo.

As interações a nível uterino enquadram eventos de membrana espermática associados a adesão dos HDLs (lipoproteínas de alta densidade) presentes no trato reprodutor feminino; mediando a troca do colesterol e fosfolipídeos na membrana plasmática do espermatozóide, conferindo alteração na permeabilidade das membranas, facilitando a entrada de cálcio, por ativação da fosfolipase A e desencadeando o processo de capacitação espermática e posteriormente a reação acrossomal. Anteriormente já foi descrito que algumas proteínas presentes no PS serviriam como pontes de ligação para os HDLs, facilitando tal interação.

No oviduto, ocorrem eventos importantes para uma futura gestação, como o transporte de gametas, capacitação espermática e reação acrossomal, fertilização (adesão e penetração) e desenvolvimento embrionário precoce.

A influência desta estrutura anatômica feminina na função espermática é assunto também de muitos estudos. Ainda devemos nos deparar com diferenças de fisiologia dentre as três porções do oviduto (ampola, istmo e infundíbulo). A ampola age na função espermática promovendo a fertilização, já a região do istmo prolonga a viabilidade espermática, inibe a motilidade, promove capacitação espermática e ligação com zona pelúcida. Tais fenômenos talvez se devam pelas diferenças de composição do fluído encontrado em cada uma destas porções. O fluído ampolar contém uma grande de fosfolipídeos (fosfatidilcolina) e uma proteína denominada EAP (Estrus Associated Protein - 97KDa), enquanto que o fluído do istmo contém grande quantidade de colesterol, Phospholipase A2 e cálcio. A EAP é uma proteína encontrada sob múltiplas que se adere a membrana espermática, participando do metabolismo espermático a despeito de capacitação espermática e habilidade de fertilização. Em geral também pode-se encontrar outras proteínas no fluído de oviduto que se aderem a membrana espermática como OPN (encontrada sob 3 formas), PGDS (função enzimática de prostaglandina H2 e D2) e Haptoglobulina (Hp – 57Kda - proteína sérica encontrada em bovinos em fase aguda de infecção, em outras espécies é componente normal do soro, com possível papel antioxidante no fluído de oviduto). O grupo dirigido por KILLIAN, G., PhD na Universidade da Pensilvania - State College - USA é quem esta desenvolvendo algumas pesquisas voltadas a esta área.

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23/05/00

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