RESUMO

OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE EMBRYONIC STEM CELLS BOVINAS: RESULTADOS PRELIMINARES

Garcia, J.M.¹; Wolf, A.¹; Smith, L.C.²

Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS, Porto Alegre, v.26, n.1, p.224, 1998 (Supl.)

As investigações com teratocarcinomas e embryonic stem cells (ES-Cells) tiveram início na década de 80 e, a metodologia para obtenção, manutenção e utilização destas células na produção de animais quiméricos está melhor estabelecida em murinos que nas outras espécies. Nos bovinos, esta metodologia ainda apresenta inúmeras barreiras, principalmente na manutenção da indiferenciação celular. Em uma avaliação inicial, com estabelecimento de ES-Cells de bovinos, 28 blastocistos expandidos produzidos in vitro tiveram a zona pelúcida e o trofoblasto removidos mecanicamente com auxílio de um tubo capilar de diâmetro ajustado para 50m m ou lâmina de bisturi. A massa celular interna (MCI) foi desagregada mecanicamente e cultivada em microgotas de 100m l de meio DMEM com 4,5% de glicose, suplementado com 15% de soro fetal bovino (SFB), 0,1mM de 2-mercaptoetanol, 2mM de L-glutamina, 0,1mM de aminoácido não essenciais e 30m M de nucleosídeos (adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina; ES-DMEM), sobre monocamada de fibroblastos primários fetais murino inativados (FPFM-inativado) com 2m g de mitomicina C por ml de meio DMEM. Após 48 horas de cultivo, a 39° C e atmosfera de 5% de CO₂ para fixação na monocamada, o meio ES-DMEM era removido a cada 48-72 horas, durante 10 a 14 dias. As colônias estabelecidas foram avaliadas morfologicamente e, as que apresentavam-se com características de ES-Cells (Stice et al., 1996), eram repicadas mecanicamente em pequenos fragmentos com auxílio de lâmina de bisturi e transferidos para placas de 35mm, contendo 2ml de meio ES-DMEM e monocamada de FPFM-inativado. Após 3 repiques as linhas eram caracterizadas citogeneticamente para identificação do sexo e balanceamento cromossômico. Das 28 MCI cultivadas inicialmente foram obtidas 8 linhas com características de ES-Cells, sendo 3 machos e 4 fêmeas, com 85% a 95% de células 2n balanceadas e 5 a 15% de células 4n. Uma linha de células não foi possível sua identificação. Entre o 4° e 8° repique, parte das colônias foram congeladas em DMEM com 20% de SFB e 10% de glicerol, para posterior caracterização e avaliação do grau de indiferenciação.

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