RESUMO

AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA MONOCAMADA E DO ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO SOBRE O ISOLAMENTO DE LINHAS CELULARES DE EMBRIÃO BOVINO

Wolf, A.¹; Garcia, J.M.¹

Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS, Porto Alegre, v.27, n.1, p.298, 1999 (Supl.).

A metodologia para obter e manter linhas de embryonic stem cells (ES-cells) ainda não está definida para bovinos. Objetivando avaliar a influência da monocamada de sustentação e do estádio do desenvolvimento embrionário na obtenção e manutenção de linhas celulares bovinas semelhantes às ES-cells (ES-cells like) foram utilizadas para o cultivo de embriões bovinos no estádio de mórula (Mo) e blastocisto expandido (Blx) produzidos in vitro seis diferentes monocamadas: fibroblasto primário fetal bovino (FPFB), fibroblasto primário fetal murino (FPFM), células endometriais da região caruncular bovina (CEB), puras e em associação com 30% de células do fígado de Rato Búfalo Imortalizadas (BRL). A massa celular interna (MCI) de 120 Blx foi isolada por microcirurgia e implantada mecanicamente sobre as diferentes monocamadas. A zona pelúcida de 124 Mo foi removida com 0,5% de pronase em PBS, seus blastômeros desagregados em PBS livre de cálcio e magnésio acrescido de 0,5 mM de EDTA e depositados individualmente sobre as diferentes monocamadas. O isolamento primário foi realizado em microgotas de 100m l de meio alfa-MEM, com 4,5% de glicose, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 0,1 mM de 2-mercaptoethanol, 0,1 mM de amino ácidos não essenciais, 70m g de penicilina e 50m g estreptomicina/ ml de meio (ES-a MEM). As colônias formadas deste isolamento primário sofreram dois repiques mecânicos, com intervalos de 10 dias, para placas de 35 mm contendo as diferentes monocamadas, inativadas com 2m g de mitomicina C/ml de meio DMEM, e 2 ml de meio ES-a MEM. Cada colônia foi repicada para o mesmo tipo de monocamada do isolamento. A eficiência para o isolamento primário e o desenvolvimento nos dois primeiros repiques não mostraram influência (p<0,05) dos tipos de monocamada, dentro dos grupos Mo e Blx. Ao compararmos os totais gerais de Mo e Blx no isolamento primário e nos dois repiques sucessivos foi verificado vantagem (p<0,05) para as Mo (46%, 37% e 30%) em relação ao Blx (30%, 23% e 18%) para formar colônias de ES-cells like. Entretanto, estas linhas iniciais ainda não foram caracterizadas sob o aspecto bioquímico (fosfatase alcalina), imunológico (anticorpos de reconhecimento dos fatores stem cell murino e humano e, matrizes celulares) e citogenético (sexo e balanceamento cromossômico) para a avaliação da indiferenciação celular.

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