© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ,1998
УДК 340.64:616-079.3:575
поступила в редакцию 28.10.97

Государственный научный центр "ГосНИИ генетика" (дир. - чл.-корр. РАН В.Г. Дебабов);
Республиканский центр судебно-медицинской экспертизы (дир. - проф. В.В. Томилин) Минздрава РФ;
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта (дир. - акад. А.Д. Мирзабеков) РАН, Москва

В Государственном научном центре "ГосНИИ генетика" разработан ряд амплификационных систем на основе высокополиморфных тетрануклеотидных микросателлитов из семейства повторов гена фактора фон Виллебрандта (von Willebrand factor gene, vWF) и локуса D6S366. В настоящей работе представлены результаты комплексной экспертной оценки двух таких молекулярно-генетических индивидуализирующих систем - на основе локусов HUMvWFII и D6S366 - в плане их использования в судебно-медицинской идентификационной экспертизе.

PMID: 9608260
Sud. Med. Ekspert., 1998, 41 (2), 33-36.

Amplification systems based on highly polymorphic tetranucleotide microsatellites from the family of von Willebrand factor gene (vWF) and locus D6S366 repeats are developed at the State Research Center Gos-NII Genetika. A complex expert evaluation of two such molecular genetic individualizing systems based on loci HUMvWFII and D6S366 is performed in order to investigate their probable use in forensic medical personality identification.

В арсенале судебно-экспертного молекулярно-генетического идентификационного анализа ведущее место занимают методы, основанные на энзиматической амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) гипервариабельных мультиаллельных генетических локусов. Эти локусы в геноме человека представлены главным образом так называемыми тандемными повторами с вариабельным числом копий (англ. - variable number of tandem repeats, VNTR) [20]. Класс тандемных полиморфных локусов условно разбит на два подкласса: минисателлитов - с длиной повтора семь и более пар нуклеотидов (п.н.) (часто именно их имеют ввиду под наименованием VNTR) и микросателлитов, у которых длина повторяющейся единицы составляет от одного до десяти п.н. и которые еще называют короткими тандемными повторами (англ. - short tandem repeats, STR) [24].

Благодаря высокому аллельному полиморфизму, локусы как VNTR-, так и STR-типа находят широкое применение в качестве молекулярно-генетических маркеров при производстве судебно-медицинских экспертиз (идентификация личности, определение отцовства и материнства и др.) и в прикладных медико-криминалистических исследованиях. Однако следует отметить, что эти две группы маркеров не вполне эквивалентны по своим прикладным свойствам. Так, существенные ограничения накладываются на ПЦР-анализ минисателлитных VNTR-локусов при исследовании деградированных препаратов ДНК (например, выделенных из пятен крови, спермы, слюны, а также частей волосяного покрова и трупного материала, подвергшихся разложению под действием разрушающих биологических или физико-химических факторов). При анализе подобных препаратов часто наблюдается полное отсутствие электрофоретических полос в аллельном диапазоне, что, как правило, свидетельствовует о полной деградации в образце аллелей анализируемого локуса и следовательно, о невозможности проведения генотипирования. Если же при анализе деградированного образца ДНК обнаруживается только один низкомолекулярный аллель, то в этом случае существует опасность ложной гомозиготности: возможно, анализируемый образец на самом деле является гетерозиготным, но имеющийся высокомолекулярный аллель не выявляется в ходе исследования, поскольку степень его деградации в "плохих" образцах существенно выше степени деградации низкомолекулярного [2].

С этой точки зрения ПЦР-типирование микросателлитных STR-локусов оказывается предпочтительнее. Благодаря более коротким, по сравнению с минисателлитными VNTR, размерам аллелей, во-первых, выше вероятность сохранения их в деградированной ДНК, а во-вторых, не столь велика вероятность искажения генотипа из-за потери высокомолекулярного аллеля вследствие его преимущественной деградации. На практике это означает ощутимый выигрыш в чувствительности анализа. Кроме того, вероятность ложной гомозиготности, обусловленной предпочтительной амплификацией [26] низкомолекулярных аллелей, крайне низка для микросателлитных локусов вследствие узости спектра аллельных длин.

За последние годы за рубежом было разработано большое число молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе микросателлитных полиморфных локусов [6, 18, 25]. Из наиболее известных можно упомянуть такие панели для идентификации личности как 7-STR Forensic Science Service (Великобритания, 1995), 9-STR GenePrint^TM ("Promega Corporation", США, 1996), 3-STR AmpFlSTR^TM Blue ("PE Applied Biosystems", США, 1996), 13-STR Baylor College of Medicine (США). Между тем в последнее время исследования по созданию новых высокоинформативных панелей STR-локусов для целей судебно-экспертного использования проводятся и в нашей стране. В частности, в Государственном научном центре "ГосНИИ генетика" были разработаны оригинальные амплификационные системы на основе высокополиморфных тетрануклеотидных микросателлитов из семейства повторов гена фактора фон Виллебрандта (von Willebrand factor gene, vWF) и локуса D6S366 [3, 5].

С помощью ПЦР в 40-м интроне гена vWF, имеющего хромосомную локализацию 12p13.3 - p13.2 [12, 19, 22], выявляется 3 дистанциированных друг от друга полиморфных микросателлита мотива (ATCT)_n/(AGAT)_n. Для микросателлита HUMvWFI, расположенного в 5'-концевой части 40-го интрона, в европейских популяциях обнаружено 11 аллелей [1, 4, 10]. Для микросателлита HUMvWFII, находящегося в 3'-концевой части полиморфного участка (позиции 2215 - 2380 п.н.), показано существование 7 аллелей длиной от 154 до 178 п.н. [5, 10]. Для микросателлита HUMvWFIII, который также обозначается как HUMvWFA31/A (позиции 1640 - 1794 п.н.), было показано существование 7-12 аллелей при анализе различных расовых групп [18, 25]. Для микроcателлита D6S366 (обозначение по Genome Database), расположенного на хромосоме 6q21-qter, известно 10 аллелей размером от 138 до 174 п.н. [5, 16].

В настоящей работе проведена комплексная экспертная оценка молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе локусов HUMvWFII и D6S366.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследовали препараты ДНК, выделенной из объектов, представляющих потенциальный судебно-медицинский интерес (образцы жидкой крови и пятна крови различного происхождения и степени сохранности; содержащие сперму образцы выделений из влагалища; кости; жидкая сперма и пятна спермы; волосы, содержащие луковичную часть; слюна, окурки сигарет).

Выделение ДНК. Из препаратов жидкой крови, пятен крови, смешанных образцов из влагалища, костного материала, спермы и пятен спермы , волос, слюны, окурков сигарет ДНК выделяли по описанным ранее методикам с использованием фенол-хлороформной экстракции и(или) хелатирующего полимера Chelex^R-100 ("Bio-Rad Laboratories", США) [7]. Для некоторых образцов проводили дополнительную очистку и концентрирование с использованием колонок для ультрафильтрации Centricon^TM-100 или Microcon^TM-30 ("Amicon", США). Концентрацию ДНК в образцах определяли электрофоретически (сравнивая с известными разведениями ДНК фага лямбда) или использованием минифлуориметра DyNA Quant 200 ("Pharmacia", Швеция).

AMP-FLP-анализ. Исследования выполняли на амплификационных наборах, разработанных в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии "ГосНИИгенетика" (Москва). ПЦР проводили на амплификаторах РНС-2 ("Techne", Великобритания), PolyChain ("Polygen", Австрия), PTC-100 ("MJ Research Inc.", Великобритания), Omn-E, TouchDown ("Hybaid", Великобритания), 9600 GenAmp System ("Perkin-Elmer", США), Циклотемп-2, -4, -5 ("СТМ", Россия).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в нативном полиакриламидном геле (ПААГ) (8-12%T, 5%C, толщина 0,6 мм); электрофорез проводили в трис-боратном буфере в течение 4 ч при напряженности поля 25В/см, длина пробега амплифицированных аллелей составляла 10 см. По окончании электрофореза гель окрашивали серебром [9].

Идентификацию амплифицированных аллелей осуществляли с помощью наборов специфических аллельных маркеров (аллельных "лестниц") для обоих локусов [5]. Аллельная "лестница" для HUMvWFII включала в себя 7 известных аллелей данного локуса: №9 (154 п.н.), №10 (158 п.н.), №11 (162 п.н.), №12 (166 п.н.), №13 (170 п.н.), №14 (174 п.н.), №15 (178 п.н.); для D6S366 - 8 известных аллелей данного локуса: №10 (142 п.н.), №11 (146 п.н.), №12 (150 п.н.), №13 (154 п.н.), №14 (158 п.н.), №15 (162 п.н.), №16 (166 п.н.), №17 (170 п.н.). В обоих случаях нумерация аллелей отражает число содержащихся в них тандемных повторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для образцов ДНК, выделенных из жидкой крови (всего было исследовано 150 образцов), на различных моделях амплификаторов устойчивые воспроизводимые результаты наблюдали при концентрациях ДНК-матрицы в реакционной смеси в диапазоне 40 пг/мкл - 3 нг/мкл. В этом случае для получения электрофоретических полос удовлетворительной интенсивности достаточным было нанесение 20% общего объема реакционной смеси на дорожку геля после проведения 32 циклов амплификации. Воспроизводимость результатов не зависела от общего объема реакционной смеси (25, 30 или 50 мкл) и модели использовавшегося прибора, в том числе от такого параметра, как наличие/отсутствие нагреваемой крышки. Тем не менее, комбинированное использование тонкостенных пробирок (типа Perkin-Elmer #801-0537) и приборов с нагреваемой крышкой позволило вдвое (в среднем) сократить общее время реакции без снижения ее эффективности. Так, для локуса HUMvWFII стандартная программа амплификации - 94⁰C/1 мин, 55⁰C/1 мин, 72⁰C/1 мин, - была редуцирована до 94⁰C/30 с, 55⁰C/30 с, 72⁰C/30 с, в том числе первая денатурация - 4 мин, последний синтез цепи - 10 мин.

Условия электрофоретического анализа продуктов реакции, описанные в экспериментальной части, обеспечивают позиционное разделение соседних аллелей (различающихся на 4 п.н.) не менее чем на 2 мм, что является достаточным для уверенного генотипирования с использованием аллельных "лестниц". Отметим, что для обоих локусов в ходе реакции амплификации помимо ожидаемых продуктов происходит также наработка неаллельных (неспецифических) более высокомолекулярных фрагментов в диапазоне длин 210 - 270 п.н., которые по этой причине присутствуют в аллельных "лестницах". Поэтому для облегчения интерпретации результатов целесообразно использование одной дорожки в геле для высокомолекулярного стандарта ДНК с набором фрагментов известной длины (в настоящей работе использовались ДНК фага fX174/HincII и плазмидная ДНК pBR322/МspI).

На Рис.1 приведен пример генотипирования по локусу HUMvWFII образцов ДНК, выделенной из жидкой крови одиннадцати неродственных человек. Разная интенсивность электрофоретических аллельных полос отражает зависимость эффективности наработки продукта от исходной концентрации ДНК-матрицы в реакционной смеси. При внесении в реакцию образца ДНК в количестве менее 40 пг в расчете на 1 мкл объема реакционной смеси в ряде случаев после 32 циклов продукт не визуализировался. При увеличении исходного количества матрицы более 3 нг в 1 мкл объема реакционной смеси в ряде случаев наблюдалась интенсивная наработка нежелательных дополнительных фрагментов. В оптимизированном же количественном диапазоне ДНК-матрицы (40 пг - 3 нг/мкл общего объема) концентрационно-зависимый эффект предпочтительной амплификации низкомолекулярного аллеля в гетерозиготных образцах не проявлялся: во всех случаях интенсивность обеих аллельных полос была одинакова.

В результате генотипирования указанной выборки образцов крови нами были выявлены все основные аллели, присутствующие в аллельных "лестницах" (7 - для HUMvWFII и 8 - для D6S366). "Мутантных" фрагментов (имеющих промежуточную длину по сравнению с фрагментами аллельных "лестниц") обнаружено не было. С одной стороны, это свидетельствует о высокой специфичности и устойчивости исследованных индивидуализирующих систем в оптимизированных условиях (концентрации реагентов и параметры термоциклирования); с другой стороны, можно с уверенностью предполагать относительную редкость атипичных аллельных вариантов, что в принципе облегчает межлабораторное сравнение результатов генотипирования по данным локусам.

В исследованной популяционной выборке для локуса HUMvWFII нами впервые продемонстрировано существование нового редкого аллеля №8 длиной 150 п.н. (см. рис. 1), не обнаруженного другими исследователями. Отметим, что этот единичный случай зарегистрирован у этнического перса. Для локуса D6S366 новых аллелей отмечено не было. Однако данные литературы [13] свидетельствуют о существовании для этого локуса в других расовых группах (латиноамериканцы, негры и выходцы из Азии, проживающие в США) аллелей №9 (138 п.н.) и №18 (174 п.н.), которые не обнаружены в исследованных российских популяциях [3, 5]. Таким образом, нельзя исключить возможность выявления новых аллелей при увеличении объема популяционного материала.

С использованием обеих рассматриваемых индивидуализирующих систем был проведен семейный анализ (рис. 2) ряда родительских пар и их детей (всего 30 мейозов). Во всех случаях материнство рассматривали как бесспорное, а отцовство подтверждали типированием четырех-шести VNTR-локусов: D1S80, D1S111, ApoB, IgH, D17S5, RB1 [8, 11, 14, 16, 17, 23,]. Вероятность отцовства в обследованных парах для указанной панели локусов составляла не менее 99,98%, чему соответствует словесная формулировка "практически доказано" [цит. по 15] (расчеты вели на основе алгоритма Байеса с использованием "потолочных" частот встречаемости аллелей в русской популяции [3]. На этом материале нами был показан менделевский характер наследования аллелей в исследованных локусах; мутантные аллели не были выявлены.

На рис. 3 приведены примеры генотипирования по локусу HUMvWFII препаратов ДНК, полученных из различных объектов, типичных для судебно-медицинского экспертного иследования вещественных доказательств. Во всех случаях при сравнительном анализе результатов амплификации нативных и в разной степени деградированных образцов ДНК из одного источника эффект ложной гомозиготности обнаружен не был: в гетерозиготных образцах аллельные полосы либо не выявлялись (полная деградация), либо нарабатывались с одинаковой интенсивностью (при исследовании образцов ДНК, выделенных из биологических следов, в каждом раунде амплификации осуществляли постановку в отдельной пробирке негативного контроля, содержащего все компоненты реакционной смеси с добавлением вместо образца ДНК такого же объема деионизованной воды).

Для образцов ДНК, выделенных с использованием хелатного полимера Chelex^R из таких объектов, как пятна крови различного происхождения и степени сохранности, образцы содержимого влагалища с присутствием спермы, жидкая сперма и пятна спермы, слюна, при концентрация матрицы ДНК в реакционной смеси в диапазоне 0,2-3 нг/мкл, результаты амплификации были удовлетворительными примерно в 90% случаев без дополнительной ультрафильтрации через Centricon^TM-100 или Microcon^TM-30.

Для таких объектов, как кости, волосы (содержащие луковичную часть), окурки сигарет, результативность амплификации составляла около 50% без ультрафильтрации и повышалась до 90% после очистки через Centricon^TM-100 или Microcon^TM-30.

В предыдущих исследованиях, касающихся данных локусов [3, 5], было продемонстрировано соответствие распределения частот встречаемости генотипов в российских городских популяционных выборках равновесию Харди-Вайнберга, определены параметры информативности и "потолочные" частоты встречаемости аллелей в русской популяции. С учетом этих данных результаты настоящей работы позволяют считать весьма перспективными молекулярно-генетические индивидуализирующие системы на основе тетрануклеотидных тандемных повторов HUMvWFII и D6S366 для применения в судебно-экспертной практике. В таблице приведены объединенные данные по частотам встречаемости аллелей данных локусов, которые следует использовать для соответствующих вероятностных расчетов.

Частоты встречаемости аллелей в локусах HUMvWFII и D6S366 в русской популяции

¹ Нумерация аллелей отражает число содержащихся в них тандемных повторов
² ± стандартная ошибка
³ Значения частот встречаемости аллелей рассчитаны на основе объединенных данных для московской и томской городских популяций

ЛИТЕРАТУРА

1. Асеев М.В., Скакун В.Н., Баранов В.С. // Генетика. -1995.- Т.31. - С.839-845.
2. Гыскэ Л.И., Иванов П.Л. // Суд.-мед. эксперт. - 1995. - №3. - С.36-40.
3. Ефремов И.А. Исследование аллельного полиморфизма микро- и минисателлитных локусов генома человека методом амплификации ДНК. // Дисс. ... канд. биол. наук. - М., 1996.
4. Мисюрин А.В., Сурин В.Л., Соловьев Г.Я. // Генетика. - 1994. - Т.30. - С.713-717.
5. Чистяков Д.А., Eфремов И.А., Одинокова О.Н., Носиков В.В. // Молекулярная биология. - 1996. - Т.30, №6. С.1274-1283.
6. Alford R.L., Hammond H.A., Coto I., Caskey C.T. // Am. J. Hum. Genet. - 1994. - Vol.55. - P.190-195.
7. AmpliType User Guide, Version 2. The Perkin-Elmer Corporation. - Norwalk, 1993.
8. Boerwinkle,E., Xiong,W., Fourest,E., Chan,L. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1989. - Vol.86. - P.212-216.
9. Budowle B., Chakrabotry R., Giusti A.M. et al. // Am. J. Hum. Genet. - 1991. - Vol.48. - P.137-144.
10. Cumming A.M., Armstrong J.G., Pendry K. et al. // Hum.Genet. -1992. - Vol.89. - P.194-198.
11. Decorte,R., Cuppens,H., Marynen,P., Cassiman,J.-J. // DNA Cell. Biol.- 1990 - Vol.91. - P.461-469.
12. Ginsburg D., Handin R.I., Bonthron D. et al. // Science. - 1985. - Vol.228. - P.1401-1406.
13. Hammond H.A., Jin Li, Zhong Y. et al. // Am. J. Hum. Genet. - 1994. - Vol.55. - P.175-189.
14. Horn,G.T., Richards,B., Klinger,K.W. // Nucleic Acids Res. - 1989. - Vol.17. - P.6855-6864.
15. Hummel K., Ihm P., Schmidt V. Biostatistische Abstammugsbegutachtung mit blutgruppenbefunden. Stuttgart, 1971.
16. Jeffreys A.J., Wilson V., Neumann R., Keyte J. // Nucleic Acids Res. - 1988. - Vol.16. - P.10953-10971.
17. Kasai K., Nakamura Y., White R. // J. Forensic Sci.- 1990.- Vol.35.- P.1196-1200.
18. Kimpton C., Walton A., Gill P. // Hum. Mol. Genet. - 1992. - Vol.1. - P.287.
19. Mancuso D.J., Tuley E.A., Westfield L.A. et al. // J. Biol. Chem. - 1989. - Vol.264. - P.19514-19527.
20. Nakamura Y., Leppert M., O'Connel P. et al. // Science. - 1987. - Vol.235. - P.1616-1622.
21. Ploos van Amstel H.K., Reitsma P.H. // Nucleic Acids Res. - 1990. - Vol.18. - P.4957.
22. Peake I.R., Liddell M.B., Moodie P. et al. // Blood. - 1990. - Vol.75. - P.654-661.
23. Scharf S.J., Bowcock A.M., McClure G. et al. // Am. J. Hum. Genet. - 1992. - Vol.50. - P.371-381.
24. Tautz D., Renz M. // Nucleic Acids Res. - 1984. - Vol.12. - P.4127-4138.
25. Urquhart A., Oldroyd N.J., Kimpton C.P., Gill P. // BioTechniques. - 1995. - Vol.18. - P.116-121.
26. Walsh S.P., Erlich H.A., Higuchi R. // PCR Methods and applications. - 1992. - Vol.1. - P.241-250.