Описание к наборам реагентов ТАПОТИЛИ

(ТАндемные ПОвторы для ТИпирования ЛИчности)

Ниже приводится краткое описание, для получения общего представления.
Вы также можете скачать и прочитать последнюю полную версию (документ MS Word, сжатый файл tapotili.zip, 300К)

Предназначение

Наборы предназначены для использования судебно-медицинскими и криминалистическими экспертизами, медико-диагностическими лабораториями при решении задач, связанных с идентификацией личности, определением пола, установлением родственных связей, в том числе спорного отцовства (материнства) и т.п. С использованием данных наборов и метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) генотипирование биологического материала человеческого происхождения может производиться в монолокусном формате по перечисленным здесь высокополиморфным локусам генома человека.

Исследование ДНК является важнейшей составной частью и одним из наиболее мощных методов анализа биологического материала в судебно-медицинских и криминалистических исследованиях. Эффективность расследования судебно-медицинских случаев и ряда преступлений может быть существенно повышена при применении комплекса методик исследования специфических свойств ДНК, выделенной из различных тканей и биологических жидкостей (крови, спермы, слюны, кожи, волосяного покрова и др.).

Геном человека содержит огромное число полиморфных локусов, значительная часть из которых представлена так называемыми тандемными повторами с изменяющимся числом копий. Вследствие высокого уровня полиморфизма, локусы этого типа нашли широкое применение в качестве генетических маркеров при изучении генома человека, в частности, при решении задач, относящихся к ведению судебно-медицинской экспертизы и криминалистики. Этот класс полиморфных локусов условно разбит на два подкласса:

Аллельный полиморфизм микро- и минисателлитов в первую очередь основан на различиях в числе тандемных повторов, содержащихся в разных аллелях, то есть на полиморфизме "длины", нежели "последовательности". Число тандемных повторов в конкретном аллеле может изменяться от одного до нескольких десятков. Обычно в популяции обнаруживается определенный спектр аллелей, отличающихся друг от друга по числу повторяющихся единиц, а у каждого человека имеется строго по два аллеля каждого полиморфного локуса равной (гомозиготный генотип) или разной (гетерозиготный генотип) длины. Таким образом, аллельный полиморфизм мини- и микросателлитов может быть эффективно использован для идентификации личности, поскольку профиль генотипов по нескольким полиморфным локусам является практически уникальным для каждого человека (исключая однояйцевых близнецов).

Методам типирования вариабельных локусов генома человека, основанным на гибридизации препаратов ДНК с мульти- и монолокусными ДНК-зондами, присущ ряд ограничений, обойти которые позволяет использование метода ПЦР (от англ. polymerase chain reaction, PCR). К достоинствам ПЦР, являющейся в настоящее время наиболее широко используемым методом, следует отнести:

В настоящее время анализ определенного набора локусов генома человека ПДАФ-типа (Полиморфизм Длин Амплифицируемых Фрагментов, аналогичный английский термин AMPlified Fragment Length Polymorphism, AMP-FLP method) широко используется в прикладных судебно-медицинских и криминалистических исследованиях, особенно в условиях дефицита биологического материала. Так, по данным опроса, проведенного корпорацией Perkin-Elmer еще в ноябре 1994, из 49 опрошенных криминалистических лабораторий США, 95% использовали в своей практике анализ ДНК, в том числе метод ПЦР. Причем только ПДАФ-исследования (без дополнительного анализа белковых маркеров и/или ПДРФ) использовали 15,4% лабораторий.
Сейчас в нашей стране и за рубежом используется большое количество молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе различных локусов ПДАФ-типа. Данный метод позволяет идентифицировать аллели, различающиеся между собой по длине на один повтор (и даже на 1 нуклеотид), точно определять размеры аллелей. Дискретность спектра распределения аллелей позволяет оперировать конкретными генотипами по таким локусам.

Принцип метода и характеристика наборов

Принцип метода полимеразной цепной реакции состоит в многократно повторяющихся циклах синтеза (амплификации) специфической области ДНК-мишени в солевом буфере в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTPs) и пары олигонуклеотидных праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка и служащих затравками для синтеза цепей ДНК. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать целевую ДНК в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза.

Амплификация аллелей каждого из полиморфных локусов проводится в раздельных реакционных смесях в присутствии специфической для каждого локуса пары праймеров (монолокусный формат). Условия проведения ПЦР совпадают для ряда локусов, что предопределяет возможность использования общей программы амплификации.

Аллельный спектр и параметры информативности всех локусов изучены на случайных выборках из русской популяции (не менее 100 человек в выборке) и при семейном анализе. Для каждого из локусов наблюдалось кодоминантное аутосомное распределение и менделевское наследование аллелей. Распределение наблюдавшихся генотипов в экспериментальных выборках для всех локусов подчинялось равновесию Харди-Вайнберга. На основании экспериментальных данных для каждого локуса расчитаны частоты аллелей, а также проведена консервативная оценка аллельных частот для русской популяции.

Комплектация, хранение и срок годности

Наборы ТАПОТИЛИ включают все компоненты, достаточные для постановки 100 реакций амплификации в 25 мкл реакционной смеси по одному локусу:

При соблюдении условий хранения срок годности наборов не менее 10 месяцев с момента поставки.
Возможны отдельные изменения комплектации в связи с усовершенствованием наборов.

Предуведомления

В качестве экспертного материала используют образцы венозной крови человека, сухие пятна крови или спермы, части волосяного покрова, костный материал, препараты слюны и др. ДНК выделяют различными способами в зависимости от природы исследуемого образца и его количества.

Чувствительность ПЦР позволяет типировать минимальные количества ДНК, и в этом случае опасность загрязнения обраэцов чужеродной ДНК вызывает серьезные опасения. Исследуемые образцы ДНК должны храниться отдельно от компонентов набора. Все работы по подготовке образцов для амплификации следует проводить в "чистых" условиях на протяжении всего времени во избежание ложных результатов (предпочтительно использование ламинарного бокса). Работать необходимо в перчатках, использование наконечников (с фильтром) и пробирок допустимо только один раз.
Анализ и хранение пост-реакционных смесей должен осуществляться в отдельном изолированном помещении.

Наборы ТАПОТИЛИ обеспечивают устойчивые воспроизводимые результаты при внесении в реакционную смесь >30 нг очищенной ДНК человека. Объем исследуемого образца ДНК, вносимого в реакционную смесь, зависит от природы образца, метода выделения ДНК и наличия в образце примесей, могущих ингибировать ПЦР. В целом, при отсутствии в исследуемом образце ингибиторов ПЦР, для отдельных локусов уверенная минимальная детекция показана при внесении в реакционную смесь менее 5 нг ДНК.

В большинстве случаев необходимый уровень достоверности идентификационного анализа может быть достигнут только при исследовании материала как минимум по восьми локусам.

Наборы непосредственно перед поставкой проверяются в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ГНЦ РФ "ГосНИИгенетика" на работоспособность и отсутствие посторонних загрязнений. Дата проверки проштамповывается на первой странице описания.

Наши партнеры, использующие наборы ТАПОТИЛИ в своей практической работе, перечислены здесь.

Проведение полимеразной цепной реакции

В настоящее время в составе наборов используются универсальные (для всех локусов) 10х ПЦР-буферы двух типов:

10х ПЦР-буферСостав: 166 mM (NH4)2SO4; 670mM Tris-HCl (pH 8.8 при 25oC); 0.1% Tween-20; 20mM MgCl2; 2mM каждый dNTP.
Smart 10х ПЦР-буферНовый тип универсального буфера, уже содержит Taq-полимеразу.

В состав Smart 10х ПЦР-буфера входят Smart Taq полимераза в концентрации 0,5 ед./мкл, а также стабилизатор (не оказывает ингибирующего действия на полимеразу). В остальном состав Smart 10х ПЦР-буфера такой же, как состав 10х ПЦР-буфера.
Основным преимуществом Smart 10х ПЦР-буфера является стабильность и воспроизводимость результатов даже после большого количества циклов (более 100) замораживания-оттаивания, без снижения активности ДНК полимеразы. При использовании Smart 10х ПЦР-буфера все реакции начинаются в режиме "горячего старта", также уменьшаются количество открываемых пробирок и число манипуляций при подготовке ПЦР.
По желанию заказчиков возможна комплектация наборов Smart 10х ПЦР-буфером в любых количествах, но это увеличивает общую стоимость заказа.
После завершения всех необходимых испытаний в ближайшем будущем планируется комплектация наборов только этим типом буфера. Ждем Ваших отзывов!

10х ПЦР-буферы, смесь праймеров перед каждым использованием следует полностью разморозить при комнатной температуре. После размораживания тщательно перемешайте содержимое пробирок (на Вортексе в течение нескольких секунд или же переворачивая пробирки несколько раз), стряхните содержимое пробирок на дно. Для проведения анализа одного образца по одному (любому) локусу в амплификационную пробирку вносят следующие компоненты в указанном порядке:

Деионизованная вода19,3 мкл
10х ПЦР-буфер2,5 мкл
Смесь праймеров2 мкл
Тaq-полимераза0,2 мкл
Исследуемый образец (~30 нг ДНК /мкл)1 мкл
Суммарный объем25 мкл

Постановка "отрицательного контроля" осуществляется в отдельной пробирке при каждом проведении амплификации путем добавления в реакционную смесь вместо исследуемого образца ДНК такого же объема воды.
Приготовленные реакционные смеси перемешивают; в случае использования амплификаторов без нагреваемой крышки наносят на поверхность водной фазы одну каплю минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси. После добавления всех компонентов пробирку следует сразу закрыть. Пробирки центрифугируют в течение нескольких секунд для стряхивания вниз капель на стенках и удаления пузырьков воздуха.

Помещают пробирки в амплификатор и проводят ПЦР по соответствующим программам. После завершения реакции образцы можно сразу же анализировать методом электрофореза или хранить при 2-8оС несколько недель, а при -20оС  - несколько месяцев.

Регистрация результатов

Амплифицированные фрагменты ДНК можно анализировать в агарозных (1-3%) или в 4-12% полиакриламидных гелях (ПАГ).
Визуализация продуктов ПЦР может осуществляться различными методами, включая EtBr флюоресценцию, гибридизацию по Саузерну, окрашивание гелей нитратом серебра (ПАГ).

Следует учитывать, что подвижность фрагментов ДНК и, как следствие, взаимное расположение окрашенных полос в геле при разделении в агарозных и полиакриламидных гелях сложным образом  зависит от целого ряда факторов: тип и степень очистки используемых электрофоретических реагентов, процентность геля, условия проведения электрофореза (напряжение, сила тока, температура геля), используемый высокомолекулярный стандарт ДНК. Поэтому при определении размеров амплифицированных аллелей минисателлитных локусов с использованием нелокусных высокомолекулярных стандартов ДНК в ряде случаев возможны определенные затруднения.
Здесь Вы можете увидеть изображение окрашенного серебром неденатурирующего ПАГ(6%Т, 3,3%С, длина геля 15 см, электрофорез в течение 3 часов при 250В). Высокомолекулярные стандарты ДНК:
1 - pUC19 DNA/MspI; 2 - pBR322 DNA/MspI; 3 - fX174 DNA/HinfI; 4 - pBR322 DNA/AluI; 5, 11 - 100 bp DNA Ladder. Дорожки 6...10 - семейный анализ по локусу IgH-5'VNTR.

Ниже приведен перечень поставляемых в составе наборов высокомолекулярных стандартов ДНК (маркеры молекулярного веса ДНК). Длины фрагментов указаны в парах нуклеотидов, подчеркнуты фрагменты, визуально более интенсивные):

100 bp DNA Ladder Plus:
3000; 2000; 1500; 1200; 1031; 900; 800; 700; 600; 500; 400; 300; 200; 100.

100 bp DNA Ladder:
1000; 900; 800; 700; 600; 500; 400; 300; 200; 100; 80.

50 bp DNA Ladder:
1000; 900; 800; 700; 600; 500; 400; 300; 250; 200; 150; 100; 50.

pBR322 DNA / AluI:
908; 659; 656; 521; 403; 281; 257; 226; 100; 90; 63; 57; 49; 46; 19; 15; 11.

pBR322 DNA / MspI:
622; 527; 404; 309; 242; 238; 217; 201; 190; 180; 160; 147; 122; 110; 90; 76; 67; 34; 26; 15; 9.

pUC19 DNA / MspI:
501; 489; 404; 331; 242; 190; 147; 111; 110; 67; 34; 26.

pBlueScript DNA / MspI:
710; 489; 404; 328; 242; 190; 157; 147; 110.

Учет результатов

После электрофореза на дорожках геля должны отчетливо выявляться одна (гомозиготный генотип) или две полосы (гетерозиготный генотип), соответствующие амплифицированным аллелям полиморфных локусов. Допустимо проявление дополнительных полос меньшей интенсивности в более высокомолекулярной области, нежели аллельный диапазон длин по исследуемому локусу.
Визуализация трех и более полос одинаковой интенсивности (вплоть до "частокола") в аллельном диапазоне длин свидетельствует либо о загрязнении чужеродной ДНК, либо о неспецифических условиях амплификации.
О загрязнении чужеродной ДНК свидетельствует визуализация каких-либо полос на дорожке отрицательного контроля. В таких случаях повторяют постановку ПЦР; при повторных неудовлетворительных результатах необходимо обратить внимание на стадию выделения ДНК из образца, заменить рабочие растворы для ПЦР и/или откорректировать условия проведения ПЦР на конкретном используемом амплификаторе.

Если по какому-либо минисателлитному локусу в геле визуализируется только один относительно низкомолекулярный аллель, то следует учитывать возможный эффект так называемой "предпочтительной амплификации". Этот эффект в максимальной степени проявляется в условиях переизбытка стартовой ДНК, когда в анализируемом гетерозиготном образце аллели минисателлитного локуса значительно различаются по длине. В этом случае количественная наработка ДНК полимеразой низкомолекулярного аллеля происходит гораздо в большей степени, и интенсивность свечения аллельного продукта ПЦР относительно высокой молекулярной массы значительно ниже (отсутствует вообще).
Ярко выраженный эффект "предпочтительной амплификации" может привести к ошибочному заключению о гомозиготности по данному минисателлитному локусу (так называемая "ложная гомозиготность"): анализируемый образец на самом деле является гетерозиготным, но имеющийся высокомолекулярный аллель не выявляется в ходе исследования. В сомнительных случаях следует повторить ПЦР, вводя в реакцию не более 30 нг ДНК.

Определение размеров амплифицированных аллелей для минисателлитных локусов может проводиться по нелокусным внешним стандартам (высокомолекулярные "маркерные" ДНК) с использованием специальных калибровочных компьютерных программ (могут быть поставлены дополнительно). Поскольку для минисателлитных локусов показано обусловленное наличием внутренних нуклеотидных вставок и делеций непостоянство длины тандемного повтора, то длины аллелей, определяемые в каждом эксперименте, могут незначительно отклоняться от приводимых в таблицах аллельных частот.

Более простое, уверенное и точное генотипирование достигается при использовании аллельных "лестниц", представляющих собой смесь в одной пробирке всех известных аллелей анализируемого локуса. Аллельные "лестницы" обязательны при анализе микросателлитных локусов (поставляются в комплекте).

На основе результатов генотипирования для каждого локуса по таблицам аллельных частот определяют частоты встречаемости обнаруженных аллелей в русской популяции и проводят соответствующие расчеты. В последних столбцах таблиц приводится консервативная оценка аллельных частот для европеоидного населения России (95% доверительный интервал для исследованных популяционных выборок или результаты сравнительного анализа с другими популяциями), рекомендуемые для использования при вероятностных расчетах. В сомнительных случаях, при невозможности точно отнести амплифицированный фрагмент к конкретному аллелю, следует оперировать максимальной частотой встречаемости того из аллелей, длины которых наиболее близки (больше и меньше) к определяемой длине анализируемого фрагмента. Это позволяет свести к минимуму возможность экспертной ошибки против обвиняемого.

При исследованиях случаев спорного отцовства (материнство рассматривается как бесспорное, анализируется только один предполагаемый отец) для достоверного отрицания отцовства достаточно, как правило, исключения по двум локусам. В случаях неисключения отцовства необходимый уровень достоверности исследования может быть достигнут только при исследовании не менее восьми локусов.

К бельчонку (в начало)