Локусы для определения половой принадлежности
Определение половой принадлежности пятен крови, корней волос, пятен слюны,
костных останков, зубов, влагалищных мазков и т.д. является, как правило, первичной задачей молекулярно-генетической экспертизы. Биологический материал часто бывает деградирован, в следовых количествах, а также загрязнен примесями,
включая препараты смешанного (мужского и женского) происхождения при
изнасилованиях. В таких ситуациях требуется использование надежного
молекулярно-диагностического метода для эффективного определения пола.
Описанные ниже методы определения пола удовлетворяют международным требованиям,
предъявляемым к молекулярно-генетической экспертизе с использованием ПЦР, могут
быть использованы для пренатальной диагностики пола у человека. В разных
наборах анализируются независимые локусы, что позволяет контролировать
результаты в сомнительных случаях.
DXZ1/DYZ3
Альфоидные (мультикопийные) повторы DYZ1, DYZ3, DXZ1, DXZ4 широко
распространены в ДНК половых хромосом. В 1989 г. был разработан и впоследствии
усовершенствован быстрый и эффективный метод идентификации пола (пикограммы
исходной ДНК) путем амплификации фрагментов гомологичных перицентромерных
последовательностей aльфа-сателлитной ДНК: длиной 130 (последовательность DXZ1,
размер 2 т.п.н., около 5000 копий в хромосоме Х) и 170 п.н. (последовательность
DYZ3, размер 5,5 т.п.н., около 1000 копий в хромосоме Y) [Witt & Erickson,
1989; Shiono, 1996]. Высокая копийность таких повторов гарантирует их хорошую
сохранность в деградированной ДНК и, как следствие, возможность успешной
амплификации из минимальных количеств биоматериала: специфические ПЦР-продукты
удавалось получать из человеческих костных останков возрастом около 10 тысяч
лет [Shiono, 1996].
Наборы (раздельные!) DXZ1 и DYZ3 позволяют в одной пробирке амплифицировать только один участок: на
X- или Y- хромосоме соответственно. Для определения половой принадлежности
разделение продуктов реакции можно проводить в 1,5-2%-ном агарозном геле
(нанесение 3-5 мкл пост-реакционной смеси на дорожку геля, длина геля 10 см).
Должны выявляться следующие специфические полосы: 130 п.н. (DXZ1, для любого
пола) и 170 п.н. (DYZ3, только для мужского пола).
Уникальные последовательности
АмелогенинАмплифицируемые гомологичные последовательности 1-го интрона гена амелогенина
различаются по длине в результате делеции 6 нуклеотидов в локусе AMGX [Sullivan
et al, 1993]. В целом, сравнение последовательностей генов AMGX и AMGY
(белковым продуктом генов являются амелогенины, образующие структурный матрикс
зубной эмали) выявляет наличие у них 19 областей абсолютного сходства длиной от
22 до 80 п.н., причем в гене AMGX обнаружено 5 делеций размером от 1 до 6 п.н.
и столько же делеций (от 1 до 183 п.н.) в гене AMGY [Haus-Rochholz & Weiler,
1997]. Мутации в генах амелогенина приводят к развитию amelogenis imperfecta
(сцепленная с полом разновидность гипоплазии, характеризующаяся нарушениями в
развитии зубной эмали); локус используют для молекулярно-генетического анализа
данного заболевания [Collier et al., 1997], гермафродитизма и других
наследственных заболеваний [Copelli et al., 1996]. Использование локуса
амелогенина в качестве полового ПЦР-маркера впервые предложено в Японии [Akane
et al., 1991; 1992] и в дальнейшем модифицировано в Великобритании [Sullivan et
al., 1993; Mannucci et al., 1994]. Ныне этот локус входит в состав
стандартизованных панелей локусов ДНК проектов ENFSI (European Network of
Forensic Science Institutes) и CODIS (Combined DNA Index System). Достигнута
надежная амплификация последовательностей из костных останков и зубов человека
возрастом до 8 тысяч лет [Faerman et al., 1995]; локус был успешно использован
в генетической экспертизе останков императорской семьи [Иванов, 1998]. Однако,
в сравнении с мультилокопийными альфоидными последовательностями DXZ/DYZ,
эффективность уникального амелогенинового гена не столь высока, в частности,
при анализе крайне малых количеств и/или сильно деградированных препаратов ДНК
[Shiono, 1996].
Набор позволяет одновременно (в одной пробирке) амплифицировать гомологичные
участки на X- и Y- хромосомах. Для уверенной идентификации половой
принадлежности разделение продуктов реакции следует проводить в
неденатурирующем ПАГ (6-10%T, 5%C, нанесение 1-5 мкл пост-реакционной смеси на
дорожку геля, длина геля 10 см). Должны выявляться следующие специфические
полосы: 106 (AMGX) и 112 (AMGY) п.н.
Фрагменты генов ZFX и ZFY (Zinc finger), участвующих в формировании семенников, можно амплифицировать с использованием общих праймеров в одной пробирке. После амплификации должна выявляться специфическая полоса длиной 1131 п.н. Для определения половой принадлежности производится последующее расщепление продуктов реакции (5 мкл) с использованием рестриктазы TaqI (10 единиц) в суммарном объеме 20 мкл в течение 90 минут при 65°C. При разделении продуктов рестрикции в 2%-ном агарозном геле должны выявляться разные наборы пол-специфичных фрагментов: три специфические полосы для женского и две - для мужского полов: 620+460+50 п.н. (ZFX) или 1080+50 п.н. (ZFY).
Источники: Akane A., Shiono H., Matsubara K., Nakahori Y., Seki S., Nagafuchi S., Yamada M., Nakagome Y. (1991) Sex identification of forensic speciments by PCR: two alternative methods. Forensic Sci. Int., 49, 81-88.Mannucci A., Sullivan H.M., Ivanov P.L., Gill P. (1994) Forensic application of a rapid and quantitaive DNA sex test by amplification of the X-Y homologous gene amelogenin. Int. J. Leg. Med., 106, 190-193.
Shiono H. (1996) Personal identification using DNA polymorphisms - the identification of forensic biological materials. Nippon Hoigaki Zasshi, 50, 320-330.
Sullivan K.M., Mannucci A., Kimpton C.P., Gill P. (1993) A rapid and quantitative DNA sex test: fluorescence-based PCR analysis of X-Y homologous gene amelogenine. BioTechniques, 15, 4, 636-641.
Witt M., Erickson R.P. (1989) A rapid method for detection of Y-chromosomal DNA from dried blood speciments by the PCR. Hum. Genet., 82, 271-274.
Овчинников И.В., Савельев Ю.И., Калашников А.В., Челнокова М.В., Носиков В.В., Дебабов В.Г. (1993) Определение половой принадлежности вещественных доказательств биологического происхождения методом ферментативной амплификации ДНК. Судебно-медицинская экспертиза, 36, 2, 30-31.
Условия амплификации
| 1 цикл | Первая денатурация при 94°C | 4 мин |
| 30 циклов | денатурация при 94°C | 30 сек |
| отжиг праймеров при: 58-62°C Амелогенин 58-60°C ZFX/ZFY 58°C DXZ1, DYZ3 | 30 сек | |
| синтез цепи при 72°C | 30 сек | |
| 1 цикл | Последний синтез цепи при 72°C | 5 мин |
 | Электрофореграмма по локусам DYZ3, DXZ1, AMGX и AMGY 2 – высокомолекулярный стандарт pBR322 ДНК/MspI: 201, 190, 180, 160, 147, 122, 110 п.н. 3 – фрагмент только AMGX (женский пол) 4 – фрагмент DXZ1 (любой пол) 5 - фрагмент DYZ3 (мужской пол) К562 ДНК - X/X |
К бельчонку (в начало)