3. Rutas bioquímicas de activación de caspasas. La Regulación de la apoptosis.

3.1 Introducción

La apoptosis o muerte celular programada, en sus elementos básicos, se ha conservado practicamente igual desde su organización primitiva en los nemátodos a su organización en seres supuestamente más evolucionados como en el ser humano.

Los elementos básicos, o claves en la apoptosis, son:

• La familia de proteínas Bcl-2.
• Las caspasas, enzimas que pertenecen a la familia de las cisteín proteasas y que cortan específicamente tras residuos de aspartato (de ahí su nombre C-isteín asp-artato prote-asas, el cual no tiene nada que ver con problemas capilares más o menos graves). Vease ¿Qué son las caspasas?
• La proteína Apaf-1 (CED-4 en nemátodos) que se encarga de "pasar" la señal de apoptosis desde las proteínas de la familia Bcl-2 a las caspasas.

La activación bioquímica de estos componentes clave del programa de muerte de la célula, entre ellos las caspasas, es la responsable de los cambios morfológicos que se observan durante la apoptosis, incluyendo el daño mitocondrial, la ruptura de la membrana nuclear, la fragmentación del DNA, la condensación de la cromatina, y la formación de los cuerpos apoptóticos.

3.2 La activación de las caspasas durante la apoptosis

Actualmente se conocen más de catorce caspasas. De algunas de ellas se desconoce su función; La caspasa-1 y la caspasa-11 se ha visto que principalmente participan en el procesamiento de citokinas; mientras que las caspasas 2, 3, 6, 7, 8, 9, y 10 están implicadas en la regulación y en la ejecución de la apoptosis.

Todas las caspasas apoptóticas permanecen en las células normales como proenzimas inactivos, similares a los zimógenos de la coagulación de la sangre.

Cuando las células entran en apoptosis, las caspasas se activan através de uno o dos pasos proteolíticos que acaban por cortar el péptido precursor, dando como resultado la generación de dos fragmentos (grande y pequeño) que constituyen el enzima activo.

Actualmente hay dos cascadas de activación para las caspasas, que han sido más o menos bien caracterizadas, y que son fundamentales en la regulación de la apoptosis:

• La cascada generada por los receptores de membrana ( Death Receptors ).
• La cascada desencadenada por cambios en la integridad de la mitocondria .

3.3 Activación de caspasas a través de receptores de membrana (Death Receptors)

Una de las rutas que conduce a la activación de las caspasas se inicia con la unión de los "Death Receptors" (DR) de la superficie celular con sus ligandos específicos.

Los DR son una familia de proteínas transmembrana que pertenece a la superfamilia del receptor del TNF (factor de necrosis tumoral). Incluye a Fas (CD95), al TNFR1, a DR-3 y a los receptores TRAIL (DR-4 y DR-5). Conservan una región rica en Cys en sus dominios extracelulares, Fas y TNFR comparten una región homóloga en sus dominios intracelulares denominada dominio de muerte ("Death Domain" o DD) necesario para la transducción de la señal de suicidio celular. Los ligandos activadores de estos DR están estructuralmente relacionados entre sí, perteneciendo todos ellos a la superfamilia de genes TNF.

Cuando Fas une su ligando (FasL) ocurren fundamentalmente tres eventos:

• La trimerización del receptor inducida por el ligando.
• El reclutamiento de proteínas intracelulares asociadas al receptor.
• El inicio de la activación de las caspasas.

La unión de FasL a Fas induce la trimerización de Fas (un solo FasL une tres Fas). La región citoplasmática de cada Fas, a través del DD, recluta una molecula adaptadora que también posee DD (la FADD -"Fas Asociating protein with Death Domain"-) en su extremo C-ter; la unión se realiza a través de los DD; son dominios fundamentales, ya que una simple mutación en el DD impide la transmisión de la señal de apoptosis al interior celular.

FADD también presenta un dominio fundamental en su extremo N-ter, el DED ("Death Effector Domain"). Imprescindible para reclutar las procaspasas iniciales de la cascada, como la procaspasa 8 y/o la procaspasa 10. El reclutamiento se realiza gracias a que la procaspasa 8 tiene dos DED en su N-ter através de los cuales se une al DED de FADD.

El dominio C-ter de la procaspasa 8 contiene una región homóloga de caspasas. Justo después de su reclutamiento se produce el procesamiento de la procaspasa 8 generandose los dos fragmentos catalíticos que forman la caspasa 8 activa. Se piensa que la activación es por la oligomerización de la procaspasa 8; ya que se ha visto in vitro que la dimerización de procaspasa 8 resulta en una autoactivación por proteolisis, sugiriendo la posibilidad de que las procaspasas tengan una débil actividad proteasa y que se corten una a la otra cuando ambas están muy próximas.

3.4 Regulación de la activación de caspasas por los Death Receptors

Se ha visto que se dan tres mecanismos reguladores:

• El primer mecanismo evita el reclutamiento de las procaspasas y/o su activación en el complejo nFADD-3FAS-FASL. Hay un grupo de proteinas virales, las vFLIPS ("FADD-Like ICE Inhibitory Proteins"), que poseen dos DEDs, y evitan el reclutamiento de la procaspasa 8 al competir con las procaspasas en la unión al DED de FADD. Hay un homologo de vFLIPS en mamímeros, cFLIP (también llamado Casper, I-FLICE, FLAME,...)
• El segundo consiste en la expresión de receptores señuelo ("Decoy receptors" o Dc) para el ligando TRAIL, muy relacionados con los receptores DR4 y DR5 de TRAIL, aunque el DcR1 carece de dominio citoplasmático y el DcR2 presenta el dominio de muerte (DD) de la región citoplasmática truncado. Al presentar las mencionadas características los DcR actúan inhibiendo específicamente la apoptosis iniducida por TRAIL al secuestrar al ligando evitando su unión con los "deaht receptors" DR4 y DR5". Se ha visto que los tejidos humanos normales expresan estos receptores señuelo mucho más abundantemente que los tejidos tumorales, sugiriendo la posibilidad de que la mayor sensibilidad que presentan los tumores a la apoptosis sea en parte debida a este fenómeno. También hay que señalar que existe un tercer receptor señuelo, el DcR3 capaz de unir el ligando Fas, que aumenta su expresión en los tumores de pulmón y colon; lo cual indica que en estos tumores la expresión de Dc proporciona un mecanismo de resistencia a la apoptosis.
• El tercer mecanismo para evitar el estimulo inducido por los "death receptors" consiste en inhibir directamente la activación proteolítica de las procaspasas iniciadoras (procaspasa-8 o -10). Un ejemplo de esta clase de inhibidores es la proteína viral crmA, miembro de la familia de las serpinas, que es un potente inhibidor de la procaspasa-8.

Hace poco se ha identificado una proteína de 60 kDa, denominada "silenciadora de los dominios de muerte" (SODD o Silencer Of Death Domains); esta proteína parece ser que en condiciones normales se encuentra asociada a los DD del TNF-R1 evitando la señalización expontanea, no inducida, por receptores con DD.

De cualquier forma todavía no está claro si existen otros factores implicados además de FasL, Fas, FADD y SODD.

3.5 Activación de las caspasas a través de la mitocondria

Se ha visto que "in vitro" hay tres proteínas que son necesarias y suficientes para activar a la Caspasa-3; estas tres proteínas son:

1. Citocromo c .
2. Apaf-1 .
3. Procaspasa-9 .

1. Citocromo c: Solo es funcional el holocitocromo c, no el apocitocromo sintetizado en el citoplasma. Se ha visto que la actividad inductora de apoptosis es independiente del estado redox del cyt c. Se sabe que el cyt c es liberado de la mitocondria por variados estimulos, entre los que se incluyen, agentes que dañan el DNA, inhibidores de kinasas, y la activación de los recepotres (DR) de superficie.
2. Apaf-1, proteína de 130 KDa, presenta tres dominios; el dominio N-ter tiene homología con el prodominio de distintas caspasas (1, 2 y 9); este dominio, según se ha propuesto, actuaría como dominio de unión de caspasas (CARD), uniendo caspasas que a su vez lo presentaran; de todas las caspasas con CARD solo la procaspasa-9 se activa con Apaf-1. Tras el CARD, Apaf-1 tiene una secuencia de 310 aminoácidos que presenta un 50% de similitud de secuencia primaria con CED-4 de C. elegans (proteína promotora de apoptosis); dentro de este dominio se encuentran las cajas de Walker A y B, de las cuales se piensa que son necesarias para la unión de nucleótidos (entre los cuales están ATP y dATP); mutaciones en este sitio eliminan la función tanto de Apaf-1 como de CED-4. La mitad C-ter de Apaf-1 está compuesta por 12-13 repeticiones de 40 WD, que actúan como dominio de interacción proteína-proteína; Cuando se modifica este dominio, Apaf-1 aparece constitutivamente activa "in vitro" independientemente de las concentraciones de ATP/dATP y de cyt c, aunque la caspasa-9 activa no puede liberarse, lo cual indica que este dominio presenta dos funciones en condiciones normales: inhibir la actividad Apaf-1 y favorecer la liberación de la caspasa-9 ya activada.
3. Procaspasa-9: La activación de la procaspasa-3 requiere una reacción escalonada: Primero Apaf-1 une ATP/dATP y los hidroliza a ADP y dADP respectivamente. Esta hidrólisis no tiene ninguna significancia funcional si el cyt c está ausente; lo que parece ser que ocurre es que el ATP estabiliza la unión de cyt c con Apaf-1, y la hidrólisis de ATP/dATP induce la formación de complejos multiméricos de Apaf-1 y cyt c. Estos complejos multiméricos son totalmente funcionale para reclutar y activar a la procaspasa-9. Una vez se ha formado ese complejo la procaspasa 9 es reclutada en proporción 1:1 a Apaf-1 y se activa por proteolisis; más exactamente por autocatalisis de la propia procaspasa-9

La formación de este complejo Apaf-1/cyt c puede tener dos finalidades: primero, incrementar la concentración local de procaspasa para favorecer el corte intermolecular, y segundo, establecer el umbral de acivación de las caspasas relativamente alto de tal forma que una salida ocasional de cyt c de la mitocondria no cause la muerte de la célula por apoptosis.

Ciertos autores sugieren que Bcl-xL se une a Apaf-1 y a la caspasa-9 formando un complejo denominado Apoptosoma.

3.6 Regulación de la activación de las caspasas por la mitocondria

El primer paso regulador en la activación de caspasas mediada por la mitocondria debe encontrarse a nivel de la liberación del cyt c. Una microinyección o una electroporación de cyt c induce apoptosis en cietos tipos celulares, indicando que en estos tipos celulares la liberación del cyt es un paso clave en la regulación de la apoptosis.

Los reguladores, que se conocen, de la liberación de cyt c son los miembros de la familia de proteínas Bcl-2. Se sabe que una sobreexpresión de Bcl-2 o de Bcl-xL bloquea la liberación del cyt c, mientras que, la sobreexpresión de miembros proapoptóticos de la familia, como Bax o como Bid, favorece la liberación de cyt c de la mitocondria y por tanto la entrada en apoptosis.

Los mecanísmos bioquímicos de la liberación del cyt c y de su regulación por la familia Bcl-2 aún no se conocen; por ahora nos tenemos que conformar con las tres teorías que se proponen:

1. La teoría del PTP .
2. El modelo de flujo iónico .
3. El modelo de proteínas con dominio BH3 .

-.1 La famlia Bcl-2 como reguladora del PTP

Grupo de Kroemer.

Los miembros de la familia Bcl-2 se encuentran en la cara citoplasmática de varios orgánulos, incluyendo la mitocondria, el retículo endoplasmático, y el núcleo.

Se sabe desde hace tiempo que ciertos signos de daño mitocondrial, como una pérdida de potencial de membrana, son marcadores tempranos de que la célula está destinada a la apoptosis. Los investigadores se basaron en trabajos previos que describían una actividad, denominada Poro de Transición de la Permeabilidad o PTP, encargada de regular el potencial de la membrana interna mitocondrial, especulando con la posibilidad de que el PTP pudiera estar regulado por la familia Bcl-2.

De acuerdo con la posibilidad de que la familia Bcl-2 regula el PTP hay inhibidores farmacológicos del PTP, como la Ciclosporina A, que aparecen como inhibidores de ciertos tipos de estímulos apoptóticos (p. e. la apoptosis inducida por Bax).

La identidad del PTP aún no está bien caracterizada (ver sección al respecto); se sabe que están implicadas proteínas como la ciclofilina D, el transportador de nucleótidos de adenina (ANT), ambos en la membrana interna mitocondrial, y la porina, en la membrana externa.

Todavía se desconoce cómo la apertura del PTP lleva a una pérdida en la integridad de la membrana externa, pero se especula con la posiblidad de que la disrupción de los gradientes electrostático y osmótico conduciría a la hinchazón de la mitocondria y a la liberación de calcio y de proteínas de la membrana interna como el cyt y el AIF (factor inductor de apoptosis).

-.2 Familia Bcl-2 en su papel como canales iónicos

Grupo de Thomson.

El que Bcl-2 tuviese actividad como canal iónico se sugirió a partir del estudio de la estructura tridimensional (por RMN) de Bcl-xL, dado que recuerda a la estructura de ciertas toxina bacterianas como la toxina de la difteria. Estas toxinas actúan insertándose en las bicapas lipídicas formando canales iónicos.

De acuerdo con este modelo se vió que Bcl-xL (homólogo de Bcl-2) formaba un canal catiónico en vesículas con mono o bicapas lipídicas, mientras que Bax (proapoptótico) formaba un canal aniónico.

Este grupo demostró que el hinchamiento mitocondrial y la ruptura de la membrana externa eran acontecimientos tempranos en muchas formas de muerte por apoptosis. Se vió que Bcl-xL podía proteger a la mitocondria de estos daños, sugiriendo que el daño mitocondrial sería el paso decisivo en la apoptosis.

De todas formas todavía no se ha establecido una unión directa entre el flujo de iones y la homeostasis mitocondrial.

Los investigadores del grupo de Thomson especulan con la idea de que la hichazon de la mitocondria conduciría a la ruptura de la membrana externa con la consiguiente liberación del citocromo c. Piensan que las proporciones relativas de las proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas condicionarían el flujo de iones, y consecuentemente, el de agua. Alternativamente los cananles podrían influir en la apertura de otros poros, como el PTP, que podrían regular el volumen mitocondrial.

-.3 El modelo de proteínas con dominio BH3

En contra del modelo anterior se ha visto que no todos los componentes de la familia Bcl-2 son capaces de formar poros. De hecho los dominios conservados, las hélices BH1 y BH2, responsables de la formación de los poros son inexistentes en muchas de las proteínas proapoptóticas de esta familia, entre ellas Bid y Bad. Se ha demostrado mediante experimentos mutagénicos que para la función apoptótica de estos miembros es imprescindible la existencia de una secuencia de 9-16 aminoácidos localizada en el dominio BH3.

Se ha visto que, niveles elevados de péptidos con dominio BH3 pueden inducir la liberación de citocromo c de la mitocondria. Dado que no todos los estímulos apoptóticos se pueden inhibir con inhibidores del PTP, es tentador pensar que estas proteínas, con BH3, actuarían en una ruta independiente y, de momento desconocida, de señalización de apoptosis.

Bid media en la liberación de cyt c cuando es cortado por la caspasa-8. Se ha visto que el dominio BH3 de Bid es tan importante para su actividad proapoptótica como para su abilidad para interaccionar con otras proteínas de la familia Bcl-2.

Parece ser que tras el corte por la caspasa-8 en el citoplasma, el fragmento de Bid con el dominio BH3 se transloca a la mitocondria e induce la liberación de citocromo c. Si se muta el BH3 de Bid se inhibe la liberación de cyt c y la capacidad de Bid para unirse con Bcl-2 o con Bax; pero no la capacidad de migrar a la mitocondria. Por tanto Bid podría interacciónar con una proteína diana de la membrana mitocondral que todavía no ha sido descrita; esta interacción no sería suficiente para liberar cyt c en ausencia de un dominio BH3 funcional.

La activación de la apoptosis mediada por la caspasa-8 puede transcurrir por dos vias en función de su concentración: Si la concentración de la caspasa-8 es alta la apoptosis se continúa por la activación por corte directo de diversas caspasas como la -3, la -6 y la -9. En cambio si la concentración de la caspasa-8 no es lo suficientemente elevada, entonces las caspasas "downstream" son activadas indirectamente al inducirse la liberación de cyt c mitocondrial tras el corte de Bid, de forma que la apoptosis sigue en este caso la ruta de Apaf-1. Por tanto la ruta indirecta mediada por Bid y dependiente de la liberación del cyt c representa un importante paso de amplificación en el caso de bajas concentraciones de caspasa-8. Además de la caspasa-8 otras caspasas pueden procesar a Bid, sugiriendo que Bid participa en la amplificación de varias señales apoptóticas sumadas a las provinientes de los receptores celulares.

3.7 El papel de las IAPs (inhibidores de la apoptosis)

Otro grupo de reguladores negativos de la apoptosis son las Proteínas Inhibidoras de Apoptosis o IAPs. Se han identificado en baculovirus, en Drosophila, y en humanos (siendo las de humanos las c-IAP, c-IAP-2, XIAP, survivina, y NAIP). Estas proteínas comparten un motivo común de 70 aminoácidos denominado BIR ("Baculovirus IAP Repeat"). La mayoría de las IAPs contienen dos o tres copias de BIR, además contienen en el lado C-ter de las repeticiones BIR un dominio de unión a dedos de zinc. Las proteínas c-IAP y c-IAP-2 además presentan un CARD o dominio de reclutamiento de caspasas.

La sobreexpresion de IAPs genera resistencia celular a una ámplia gama de estímulos apoptóticos. El punto exacto de la inhibición por IAPs es de momento desconocido; se proponen varios modelos. Parece ser que por un lado las IAPs inhiben la apoptosis interfiriendo directamente con la actividad catalítica de cietas caspasas, y que por otro, las IAPs pueden incluso evitar el procesado o la activación de las procaspasas u otras proteínas implicadas en su activación.

Esto último sugiere que las IAPs participen en las dos rutas mayores de la apoptosis, la ruta de los receptores de membrana y la ruta dependiente de cyt c (Apaf-1).

• En la ruta de los receptores de membrana, las IAPs bloquearían las caspasas efectoras -3 y -7, parando así la cascada de apoptosis iniciada por la caspasa-8.
• En la ruta dependiente de citocromo c, las IAPs actuarían a tres niveles:
  1. Interfiriendo directamente con la procaspasa-9 evitando su procesamiento.
  2. Mediante sus CARDs compitiendo para unir a Apaf-1.
  3. Inhibiendo directamente las caspasas activadas.

Se puede concluir que las IAPs proporcionan un mecanismo de defensa contra cualquier mínima activación del programa apoptótico, es decir, elevan el umbral para la activación de las caspasas. Los niveles celulares de estas IAPs deberían determinar las diferencias en cuanto a sensibilidad a estímulos proapoptóticos existentes en distintos tipos celulares. Por esta razón la regulación de estos niveles resulta fundamental. Se ha visto que las c-IAPs son reguladas transcripcionalmente de manera directa por el NF-kB.