Celal Bayar Universitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Dergisi, 1, 136-141.

TRIFLURALİN’İN MİKROBİYAL PARÇALANMASI

Metin DIGRAK¹

Sami OZCELIK²

¹ KSÜ Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bolümü, 46100-KAHRAMANMARAS

² Süleyman Demirel Üniversitesi Ziraat Fafültesi, Atabey-ISPARTA

ÖZET

Bu çalismada tarimda herbisit olarak yaygin bir sekilde kullanilan Trifluralin’in (2,6-dinitro-N,N-dipropyl-4-(trifluoromethyl) benzenamine) toprak bakterileri tarafindan parçalanmasi incelendi.

Pestisit uygulanan toprak ornekleri 25 °C’de 45 gün inkübe edildi ve trifluralin’i parçalayabilen bakteri Arthrobacter sp. olarak teshis edildi. Arthrobacter sp.’nin trifluralin’i parçalamasi Mineral Salts (MS) Medium’da 25°C’de 30 gün inkübe edilerek arastirildi. Bakteri asilanmayan besiyeride kontrol olarak kullanildi.

Bakteri asilanan kültürde 30. günde trifluralin seviyesi % 87.60 azaldi. Ancak herbisitin % 44.85’inin buharlasarak kayboldugu belirlendi. Kültür ortaminda 30. günde % 12.60 trifluralin kaldigi tespit edildi.

DEGRADATION OF TRIFLURALIN BY SOIL MICROORGANISMS

ABSTRACT

In this study, degradation of Trifluralin (2,6-dinitro-N,N-dipropyl-4-(trifluoromethyl) benzenamine) which used as herbicide on the agriculture was investigated by soil microorganisms.

Soil sample which applications of pesticide were incubated at 25 °C in 45 days and a bacterium the ability of degradation the tifluralin was identified as an Arthrobacter sp. Degradation of trifluralin by Arthrobacter sp. was studied Mineral Salts (MS) Medium incubated at 25 °C in 30 days. Uninoculated medium served as controls.

In the medium inoculated with this bacterium, trifluralin declined to about 87.60 % of original level in 30 days. However it was determined that 44.85 % of herbicide lost with evaporation. Trifluralin was determined in the medium 12.60 % in 30 days.

GİRİS

Günümüzde hizli nüfus artisi ve bu nüfüsun beslenmesi, dünyanin karsilastigi en onemli problemlerden birisidir. Ozellikle ekonomisi tarima dayali gelisen ülkelerin çogunda gida ihtiyacinin karsilanmasinda yerli üretim ana faktordür ve ülkenin sosyal ve ekonomik gelismesinde de çok onemli rol oynar.

Pestisitler, besin maddelerinin üretimi, tüketimi ve depolanmasi sirasinda besin degerini bozan ve bitkilere zarar veren bocekleri, mikroorganizmalari, yabanci otlari yok etmek, bununla beraber bitki büyümesini ayarlayici, yaprak dokülmesini saglayici (defoliant) ve rutubet alici (desikan) olarak kullanilan madde veya maddeler karisimina verilen genel isimdir.

Birim alandan alinan ürün miktarini artirmak için verimi yüksek tohum kullanma, uygun toprak islemesi, iyi sulama ve gübreleme yaninda kültür bitkilerini zararli organizmalardan korumak için bilinçli bir tarimsal mücadeleye gerek vardir. Hastalik, zararli ve yabanci otlar, kültür bitkilerinde % 25-30’a varan bir ürün kaybina neden olmaktadir. Bu kaybi onlemek veya en aza indirmek amaci ile, kültürel onlemler, fiziksel, kimyasal ve biyolojik adi verilen degisik savas teknikleri uygulanmaktadir. Ancak, bunlar içerisinde sonucun hemen alinabilmesi ve uygulamasinin kolay olmasi nedeniyle kimyasal mücadele digerlerine gore daha yogun olarak kullanilmaktadir (1).

Pestisitlerin kullanilmasi bir yandan tarimsal üretimi artirirken diger yandan dolayli ve dolaysiz yollardan insan sagligini etkilemektedir. İnsanlari pestisit kalintilarinin zararli etkilerinden korumak için gida maddelerinin üretiminden tüketimine kadar geçirdigi her safhada kontrol altina alinmasi gerekmektedir.

Pestisitlerin tarimsal mücadelede basari saglamalari oldukça sevindirici olmustur. Ancak, bu kimyasallarin bilimsel denetimden yoksun, gelisi güzel ve asiri dozda kullanilmalari sonunda, zararlilar disindaki yararli canlilar ve çevrenin diger unsurlari üzerine olan olumsuz etkileri bulunmaktadir. Bunun sonucu olarak da, insan ve hayvanlarda zehirlenmeler, hedef alinmayan yaban hayati, yararli canli gruplarinin oldürülmesiyle tabi dengenin bozulmasi, havada, suda, toprakta ve gida maddelerinde ilaç kalintilari, daha once ekonomik zarari olmayan bazi canlilarin zararli hale gelmesi, zararlilarin bagisiklik kazanmasi ve kisaca çevre kirlenmesi adi altinda bir çok olumsuz etkileri ortaya çikmistir.

Bu sebeple, bugün dünya ülkelerinin bir çogunda pestisitlerin üretim ve kullanimina iliskin yasal kontroller getirilmistir. Ayrica, Türkiye dahil birçok tarim ülkesinde, tarim ürünleri, içme ve kullanma sularinda izin verilebilir kalinti limitleri konulmustur. Pestisitlerin mikroorganizmalar tarafindan parçalanmasi, parçalayabilen bakteri veya mantar türlerinin tespiti üerinde degisik arastirmalar yapilmistir.

Karns ve ark. (2) topraktan izole edip Achromobacter sp. olarak teshis ettikleri bakterinin, karbofurani azot kaynagi olarak metabolizmada kullandigini belirtmektedirler. Arastirmacilar, besiyerine ilave ettikleri 200 mg / ml karbofuranin belirtilen bakteri tarafindan 42 saat süre sonunda % 99 ' unun parçalandigini tespit etmislerdir. Ayrica, karbofuran ihtiva eden Nutrient Buyyon' da Pseudomonas sp. 30 gün süreyle inkübe edilmis ve pestisitin % 95 'nin parçalandigi belirtilmistir.

Digrak ve Ozçelik (3), Chlorpyrifos-methyl’in bakteriler ve zenginlestirilmis toprak tarafindan parçalandigini tespit etmislerdir. Arastirmacilar pestisitin 35 °C’de inkübe edildigi zaman buharlasmanin daha fazla oldugunu belirtmislerdir.

Bakteri kültürleri ve toprak mikroorganizmalari tarfindan Carbaryl (1-naphthyl N-methylcarbamate) ve Carbofuran' in metabolizmasini arastirilmistir. Besiyerine substrat olarak carbaryl ilave edildigi zaman toplam bakteri sayisinin % 60-70 ni Bacillus sp. susu, carbaryl yerine karbofuran substrat olarak kullanildiginda ise Arthrobacter sp. susunun daha fazla oldugu tespit edilmistir (4).

Saccharomyces cerevisiae WET 136 tarafindan Chlorpyrifos-methyl ve Diazinonun parçalandigi, Chloridazon ve Ethionun adsorbe oldugu belirtilmektedir (5).

Chaudhry ve Ali (6), karbofuranin bakteriyal metabolizmasi üzerinde yaptiklari arastirmada, topraktan karbofurani parçalayabilen 15 bakteri izole etmislerdir. Bu izolatlarin Pseudomonas sp. ve Flavobacterium sp. suslarina ait oldugunu teshis etmislerdir. Diger bir arastirmada, karbofuran Arthrobacter sp. tarafindan 72-120 saat içerisinde azot ve karbon kaynagi olarak kullanilmistir (7).

Genellikle bakteriler tarafindan pestisitlerin parçalanmasindan sorumlu genler, bakterinin tek kromozomu üzerinde degildir. Sozkonusu genler, plazmid olarak isimlendirilen ekstrakromozomal DNA molekülleri üzerinde lokalize olmustur (8,9,10).

Bu çalismada, Kahramanmaras ve yoresinde yaygin olarak kullanilan pestisitlerden, Trifuralin in mikroorganizmalarla parçalanma durumu incelenmistir. Boylece; ülkemizde üretilip, tarim sektoründe kullanilan pestisitlerin insan ve hayvan sagligina zarar vermemeleri ve doga dengesini bozamamalari için gerekli onlemlerin alinmasi bakimindan, bu konuda yapilan ve yapilacak olan çalismalara katkida bulunmak amaçlanmistir.

MATERYAL VE METOT

Pestisit Standardi

Arastirmada,tarimda herbisit olarak kullanilan trifluralin 2,6-Dinitro-N,N-dipropyl-4 (trifluoromethyl) benzenamine (Saflik orani % 98.0) standardi, Ankara Zirai Mücadele Arastirma Enstitüsünden temin edilmistir.

Topragin Zenginlestirilmesi ve Bakteri İzolasyonu

Toprak ornegi (Organik madde % 1.61; Toplam azot % 0.11; pH 6.2), trifluralin’i parçalayabilen mikroorganizmalarla zenginlestirilmistir. Bunun için; 1 kg toprak alinarak onceden sterilize edilmis 1000 ml' lik beherlere konmustur. Üzerine 100 ml steril destile su ilave edilerek, 10 gün süre ile 25 °C de inkübe edilmistir. Belirtilen süre sonunda 10 gün araliklarla trifluralin’in sulu çozeltisinden (1 mg /kg) ortama ilave edilmistir. Hazirlanan bu ortam 45 gün süreyle 25 °C de inkübe edilmistir. Bu sürenin sonunda elde edilen toprak süspansiyonu, zenginlestirilmis toprak kültürü olarak kullanilmistir (11,12,13).

Elde edilen bu toprak kültüründen 10 g alinarak Plak Kültürü Metodu (14) ile toprak bakterileri izole edilmis ve dominant olarak gelisen koloniler Nutrient Buyyona ekilmistir. Tekrar saf kültürü yapilan kolonilerin identifikasyonu Buchanan ve Gibbons (15)’a gore yapilmistir (Tablo 1).

Saf Bakteri Kültürü Tarafindan Trifluralin’in Parçalanmasi

Trifluralin’in toplam konsantrasyonu 7 ppm olacak sekilde 200 ml Mineral Salts (MgSO₄.7H₂O 0.2 g; K₂HPO₄ 0.1 g; CaSO₄ 0.04 g; FeSO₄.7H₂O) besiyerine ilave edilmistir. Pestisitin besiyeri içerisine homojen dagilimini saglamak için iyice karistirilmistir. Topraktan izole edilen ve Arthrobacter sp.olarak teshis edilen bekteri kültürü (4.0x10⁴ kob/ml) hazirlanan bu ortama ilave edilmis ve 29 °C’ de 30 gün süreyle inkübe edilmistir. İnkübasyon süresinin farkli günlerinde (0, 3, 5,10,15, 20, 25 ve 30. gün) pestisitin parçalanma durumu Gaz Kromotografisinde (GC) analiz edilmistir (1,6,16,17).

Toplam Canli Bakteri Sayimi

Toplam canli mikroorganizma, kantitatif olarak Plate Count Agar - Oxoid (PCA) besiyerinde Plak Kültürü Metodu ile belirlenmistir. Kültür ortamindan belirtilen günlerde alinan 1 ml ornek PCA besiyerine ekilmis ve 30 °C de 24-48 saat süreyle inkübe edilmistir (14,18). Sonuçlar Koloni Olusturan Birim (KOB) olarak degerlendirilmistir.

Ekstraksiyon ve Kalinti Analizleri

Gaz kromatografisinde tayin edilen trifluralin, kültür ortamindan ekstraksiyon yolu ile elde edilmistir. İnkübasyon süreleri sonunda kültürden 5 ml alinmis ve 20 ml % 99 saflikta kloroform:dietileter (1:1) ile (Merck-Darmstad) 3 defa ekstrakte edilmistir (12,13,19).

Arastirmada, pestisit analizleri için, Packard marka 439 model gaz kromatografisi (Packard Instrument Company, Inc. 2200 Warrenville Rd., Downers Gtave, III.60515, USA) ve Shimadzu marka C-R2A model kaydedici sistemi kullanilmistir. Gaz kromatografisinin optimum çalisma sartlari asagida belirtilmistir.

Spesifik kolon olarak, 2 mm iç çap, 1000 mm uzunlugunda ve % 1.5 OV-17 ve % 1.95 OV-202, Chromosorb. WHP 80-100 mesh. dolgu maddesi ihtiva eden cam kolon kullanilmistir. Dedektor sicakligi 260 Enjeksiyon sicakligi 240 ve Kolon sicakligi 240 °C dir. Gaz akis hizlari ise Azot 20, Hidrojen 5 ve Hava 50 ml / dak. Alikonma süresi 2.830 dakikadir (Sekil 1 ve 2)

SONUÇLAR VE TARTISMA

Tarimda pamuk, domates, lahana, soya fasulyesi, yer fistigi, turunçgil ve süs bitkilerindeki yillik çayirlar ve genis yaprakli otlara karsi çimlenmeden once ve sonra kullanilabilen herbisit olan trifluralin, toprakta bakterilerle parçalanabilmektedir (Tablo 2 ve Sekil 3). Kültür ortamina ilave edilen 7 ppm trifluralin’in % 94.8’i geri kazanma sonucu elde edilmistir. Bu ise, ekstraksiyon metodunun güvenle kullanilabilecegini gostermektedir.

Trifluralin’in 30 günlük inkübasyon süresi sonunda kontrolda azalma oldugu gorülmüstür. Belirtilen pestisitin % 55.2’si buharlasarak kaybolmustur. Tutarli (20) yaptigi çalismada trifluralin’in buharlastigini belirtmektedir. Worthing ve Hance (21) trifluralinin 6-12 ay içerisinde % 85-90 oraninda kayboldugunu bildirmektedir. Yapilan çalismalar, inkübasyon süresince kontroldaki pestisit miktarinin azalmasinin buharlasma ile oldugu gorüsümüzü desteklemektedir. Arthrobacter sp. asilanan kültürde pestisitin kaybolmasi daha süratli olmus ve 30. günde trifluralin miktari %12.60 olarak tespit edilmistir. Bu süre içerisinde, herbisitin % 44.80’ni buharlasmis ve kültürdeki pestisitin % 32.5’inin Arthrobacter sp. tarafindan parçalandigi tespit edilmistir. İnkübasyon süresinin ilk 10 günü parçalanmanin yavas oldugu, daha sonraki günlerde arttigi belirlenmistir (Tablo 2). Belirtilen bu durum, bakterinin kültür ortamindaki pestisiti degerlendirmek için bir uyum donemi geçirdigini gostermektedir.

On günden sonra kültürdeki bakteri sayisi artmis, bununla birlikte trifluralinin parçalanmasi da süratlenmistir (Tablo 2). Baslangiçta kültür ortamina 4.0x10⁴ kob/ml bakteri asilanmistir. İnkübasyonun 10. günü 1 ml ornekte 2.4x10⁵ bakteri sayilmis, diger günlerde bakteri sayisi 5.9x10⁶, 7.6x10⁶, 3.9x10⁷, 5.6x10⁸ olarak tespit edilmistir. Trifluralinin parçalanmasi, inkübasyon süresinin ilk 10 gününde % 7.3’ü, diger günlerde ise sirasiyla % 20.4, %18.8, % 35.3, % 32.5 oldugu belirlenmistir.

Arthrobacter genusuna ait türlerin çok farkli organik kimyasallari karbon ve enerji kaynagi olarak kullanabildigi yapilan arastirmalarla tespit edilmistir (22-26). Ayrica klorinatli bifenilleri (27) ve bazi herbisitleri (28,29) kullanabildikleri de belirlenmistir.

Belirtilen çalismalarda gosterilen sonuçlar, yaptigimiz arastirmada buldugumuz verileri desteklemektedir. Tutarli (20) yaptigi çalismada, belirtilen herbisitin rüzgar etkisiyle uçtugunu ve ultra viyole isinlari ile bozundugunu belirtimistir. Trifluralinin biyolojik olarak da parçalandigi bu çalisma sonucunda tespit edilmistir. Daha once yapilan ve bu arastirmada elde edilen sonuçlar trifluralin’in çevrede olumsuz etkisinin olmadigini gostermistir.

Tablo 1. Arthrobacter sp.’nin Bazi Fiziksel ve Biyokimyasal Ozellikleri (Buchanan ve Gibbons,

1974)

______________________________________

Ozellik Arthrobacter sp.

______________________________________

Gram Boyama +

Hareket +

% 4.5 NaCl gelisme +

Spor olusumu -

Hücre sekli c

Sitrat +

Malonat +

Ketoglutarat +

D-riboz +

D-ksiloz +

M-inositol +

Ornithin +

Maltoz -

Prolin +

Urasil +

4-hidroksibenzoat +

Glukoz +

Gliserol +

4-aminobütirik asit +

Ramnoz -

Aspartat +

Süksinat +

Salisilat +

M-hidroksibenzoat -

5-aminovalerik asit +

Etanol +

Fenil asetat +

Ketoglukonat -

______________________________________

c. Kok veya egri çubuk

Tablo 2. Trifluralin’in Saf Bakteri Kültürü (Arthrobacter sp.) Tarafindan Parçalanma Durumu

Sekil 3. Trifluralin’in Arthrobacter sp. Tarafindan

Parçalanma durumu

KAYNAKLAR

1. Uygun, N., Sekercioglu, E., Karaca, İ. Çevre kirliligine neden olan kimyasal savas yerine Çukurova’da integre savas. 5. Bilimsel ve Teknik Çevre Kongresi, (Çevre, 89), 5-9 Haziran 1989, Sayfa 182-189, Adana.

2. Karns, J.S., Mulbry, W.W., Nelson, J.O., Kearney, P.C. Metabolism of carbofuran by a pure bacterial culture. Pesticide Biochemistry and Phsiology, 25, 211-217,1986

3. Digrak, M., Ozçelik, S. Chlorpyrifos-methyl’in Bakteriler ve Zenginlestirilmis Toprak Trafindan Parçalanmasi. F.Ü. Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi, 7,1, 57-72, 1995.

4. Rajagopal, B.S., Rao, V.R., Ngendrappa, G., Sethunathan, N., Metabolism of carbaryl and carbofuran by soil enrichment and bacterial cultures. Can. J. Microbiol., 30, 1446-1458, 1986.

5. Digrak, M. Ozçelik, S. Bazi Pestisitlerin Saccharomyces cerevisiae WET 136 Tarafindan Parçalanmasi. Ekoloji Çevre Dergisi, 1997. (Baskida)

6. Chaudhry, G. R., Ali, A.N., Bacterial metabolism of carbofuran. Appl. Environ. Microbiol. 54, 6, 1441-1419, 1988.

7. Ramanand, K., Sharmila, M., Sethunathan, N., Mineralization of carbofuran by a soil bacterium. Appl. Environ. Microbiol., 54, 8, 2129-2133, 1988.

8. Kearney, P.C., Kellogg, S.T. Microbial adaptation of pesticides. Pure and Appl. Chem., 57, 2, 389-403, 1985.

9. Mulbry, W.W., Karns, J.S., Kearney, P.C., Nelson, J.O. Identification of a plasmid-borne parathion hydrolase gene from Flavobacterium sp. by southern hybridization with opd from Pseudomonas diminuta. Appl. and Environ. Microbiol., 51,5,926-930, 1986.

10. Soyler, G.S., Hooper, S.W., Layton, A.C., King, J.M.H. Catabolic plasmids of environmental and ecological significance. Microbial Ecology, 19, 1-20, 1990.

11. Racke, K., Coats, J.R.Comparative degradation of organophosphorus insecticides in soil : Specificity of enhanced microbial degradation. J. Agric. Food Chem. 36, 193 - 199, 1988.

12. Ramanand, K., Sharmila, M., Sethunathan, N. Mineralization of carbofuran by a soil bacterium. Appl. and Environ. Microbiol., 54,8, 2129-2133, 1988.

13. Sharmila, M., Ramanand, K., Sethunathan, N., Effect of yeast extract on the degradation of organophosphorus insecticides by soil enrichment and bacterial cultures. Can. J. of Microbiol., 35, 1105-1110, 1989.

14. Collins, C. H., Lyne, P. M., Microbiological methods. Butterworths & Co. (Publishers) Ltd. London, 1985, 450 sayfa.

15. Buchanan, R.F., Gibbons, N.E. (eds). Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 8th ed., The Williams&Wilkins Co., Baltimore, 1974.

16. Karns, J.S.,Mulbry, W.W., Kearney, P.C., Biotechnology in pesticide environmental research. Pesticide Environ. Research, 3, 339-354, 1986.

17. Digrak, M., Ozçelik, S. Chlorpyrifos-methyl’in bakteriler ve zenginlestirilmis toprak tarafindan parçalanmasi. F.Ü. Fen ve Müh. Bilimler. Dergisi, 7,1, 57-72, 1995.

18. Bradshaw, L.J. Laboratory Microbiology. Fourt Edition, Printed in the United States of America, Saunders College Publishing, 436 sayfa, 1992.

19. Çelik, S. Elazig Yoresinde Kullanilan Bazi Pestisidlerin Arastirilmasi. Doktora Tezi. Firat Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Elazig, 1992.

20. Tutarli, A. Elazig’da Tarimsal Mücadele Amaciyla Kullanilan Pestisidlerin Topraktaki Kalintilarinin Arastirilmasi. Yüksek Lisans Tezi. Firat Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Elazig, 1993.

21. Worthing, C.R., Hance, J.R. The Pesticide Manual. 9th Edition. Published by the british Crop Protection Counsil. pp. 1141, 1991.

22. Brandsch, R., Hinkkanen, A.E., Decker, K. Plasmid mediated nicotine degradation in Arthrobacter oxidans. Arch. Microbiol., 132, 26-30, 1982.

23. Marks, T.S., Smith, A.R.W., Quirk, A.V. Degradation of 4-chlorobenzoic acid by Arthrobacter spp. Appl. Environ. Microbiol., 48, 1020-1025.

24. Stanlake, G.J., Finn, R.K. Isolation and characterization of a pentachlorophenol-degrading bacterium. Appl. Environ. Microbiol., 44, 1421-1427.

25. Stevenson, I.L. Utilization of aromatic hydrocarbons by Arthrobacter spp. Can. J. Microbiol., 13, 205-211.

26. Yamada, H., Asano, T., Hino, T., Tani, Y. Microbial utilization of acriylonitrile. J. Ferment. Technol. 57, 8-14.

27. Frukawa, K., Chakrabarty, A. Involvement of plasmid in total degradation of chlorinated biphenyls. Appl. Environ. Chem. 44, 619-626, 1982.

28. Clark, C.G., Wright, J.L. Detoxification of isopropyl N-phenyl-carbamate (IPC) and isopropyl N-3-chlorophenylcarbamate (CIPC) in soil and isolation of IPC-metabolizing bacteria. Soil Biol. Biochem., 2, 19-27, 1970.

29. Engelhardt, G., Zeigler, W., Walinofer, P.R., Jarczyk, H. Degradation of the triazinone herbicide metamitron by Arthrobacter sp. DMS. J. Agric. Food Chem. 30, 278-282, 1982.