MİKROORGANİZMALARIN GELİŞME ŞARTLARI
a. Gelişme Üzerine Çevrenin Etkisi:
Mikroorganizmalar çevredeki kimyasal ve fiziksel durumlardan etkilenirler. Çevre şartları mikroorganizmaların metabolik reaksiyonlarını ve büyümelerini etkiler. Isı, pH, su mevcudiyeti ve oksijen mikroorganizmaların gelişmesini etkileyen çevre faktörüdür.
b. Gelişme Üzerine Sıcaklığın Etkisi:
Her organizmanın gelişebildiği minimum ısı (gelişebildiği en düşük ısı), optimum ısı (en hızlı gelişebildiği ısı), maksimum ısı ( gelişebildiği en yüksek ısı) vardır. Optimum ısı her zaman maksimuma daha yakındır. Bu üç ısıya ana (cardinal) ısılar denir. Bu ısılar mikroorganizmanın çeşidine göre değişir. Maksimum ısının üzerinde mikroorganizmanın içindeki proteinler denatüre olur. Minimum ısının altında mikroorganizmaların neden yaşayamadığı kesin olarak belli değildir. Belki de sitoplazmik membran donar ve besin taşıma ve proton yükü (gradienti) oluşturamaz.
Sıcaklığa Göre Mikroorganizma Sınıfları:
l. Psikrofilik mikroorganizmalar.
Optimal ısı 15 °C veya altı; minimum 20 °C veya altı ve minimum 0 °C veya altındadır. Clamydomonas nivalis, psikırofiliklere örnek olarak verilebilir. Bu bir algdir ve parlak kırmızı renkli sporlar oluşturur. Kar üzerinde kırmızı renkli bölgelerde bu alg bulunur. Bu alg genel olarak yazın başında veya ortasında erimeye başlayan karlı bölgelerde görülür. Güneşli, kuru alanlarda da oldukça yaygındır. Soğuğa karşı toleranslı mikroorganizmalar 0 °C gelişebilir fakat optimum ısıları 20-40 °C dir. Topraktan, sudan ve buzdolabında saklanan süt ürünlerinden sirkeden, sebzelerden ve meyvelerden izole edilebilir.
Psikrofillerin Molekül Adaptasyonu:
Enzimleri soğukta aktiftir. Soğukta aktif olan enzimler fazlaca alfa-helix yapısı ve az miktarda da beta-sheet (tabakalı) sekonder yapı vardır. Beta (Sheet) sekonder yapı daha sert bir yapı oluşturur alfa-heliks yapısı ise soğukta bu enzimlere daha esnek yapı özelliği verir. Soğukta aktif olan enzimler daha fazla polar ve daha az hidrofobik aminoasit içerirler. Bu da proteini esnek yapar ve böylece daha kolay bükülebilir şekle girebilir.
Aktif taşıma bunlarda düşük ısılarda olur. Sitoplazmik membranlarda doymamış yağ asitleri miktarı daha fazladır. Bu yapı sayesinde membran düşük ısılarda bile sıvıdır. Doymuş yağ asitleri olsa idi membran soğukta yapışkan yapıda olacak ve fonksiyon görmeyecekti. Bazı psikrofiliklerde doymamış yağ asitleri ve katmerli çift bağlardan oluşan uzun zincirli hidrokarbonları vardır. Antartik bakterilerden dokuz çift bağlı hidrokarbon yapısı sitoplazmik membranda görülmüştür.
Donma:
Donma mikroorganizmaların gelişmesini önlemesine rağmen mikroorganizmaların ölümüne her zaman sebep olmaz. Suyla karıştırılabilen sıvılar ( gliserol ve dimethylsulfoxde; DMSO) %10 oranında mikroorganizma bulunan ortama konduğunda bunlar bakteri içine geçer ve dehidrasyonun şiddetini azaltarak onları korur. Bu maddeler koruyucu (cryoptotectants) olarak adlandırılır. Bu yöntemle mikroorganizmalar. -70 °C ile -190 °C de uzun yıllar korunur.
Yüksek sıcaklıklarda mikroorganizmaların gelişimi:
Optimal ısıları 45 °C üstünde olan organizmalara termofılik mikroorganizmalar denir. 80 °C olanlara ise hipertermofiller denir. Kaplıcalarda suların ısısı 100 °C ye yakındır. Volkanik duman püskürten küçük deliklerde bu ısı 150 °C - 500 °C dedir. Okyanusun derinliklerindeki hidrotermal deliklerde ısı 350 °C den daha fazladır. Bu alanlar Amerika, Yeni Zelanda, Japonya, İtalya, Endonezya ve Orta Afrika'da yaygındır. Dünyada en büyük ve yoğun sıcak su kaplıcası Yellowstone National Park Wyoming'de dir (92-93 °C). Buradaki mikroorganizmaların generasyon süresi bir saat gibi kısadır. Yani bunlar hızlıca bölünürler.
Canlıları gelişme ısılarına göre karşılaştırdığımızda aşağıdaki bulgular saptanmıştır.
1) Prokaryotlar ökaryotlara göre daha yüksek ısılarda yaşamaktadır.
2) En termofılik olan mikroorganizmalar Arkeobakterilerin bazı türleridir.
3) Nonfototrofılik organizmaların fototrofık formlara göre daha fazla yüksek ısılarda yaşadığı saptanmıştır.
Termofilinin moleküller adaptasyonu:
Enzimleri ve proteinleri yüksek ısılarda fonksiyoneldir. Bu da amino asit sırasındaki farklılıktan kaynaklanmaktadır. Enzimin bir veya bir kaç bölgesinde kritik amino asitler bulunması ile farklı bir şekilde katlanma olur ve bu da ısıya dayanabilme (ısı stabilitesi) özelliği enzime kazandırır. Ayrıca artmış sayıda tuz köprüleri (salt bridges ) çeşitli amino asitlerin pozitif ve negatif yükleri arasındaki iyonik bağlar ve proteinlerin hidrofobik iç kısımları yoğun olarak paketlenir. Bunlarda sulu ortamlarda genelde katlanmış olan yapının açılmasına direnir. Ayrıca membranda doymuş yağ asitleri yardır. Böylece membran yüksek ısıda stabil ve fonksiyoneldir. Doymuş yağ asitleri daha kuvvetli hidrofobik ortam oluşturur. Hiper termofılik olan Arkeobakterilerde membrandaki lipid de C40 hidrokarbonları vardır ve bunlarda gliserol ile eter bağı yaparlar. Bu membranların yapısı lipit monolayerdir (tek tabakalı lipit). Bu ısıya karşı daha dayanıklıdır.
Termofiliğin Biyoteknoloji Konuları:
Termofılik olan Thermus aquaticus'dan elde edilen Taq polimeraz (DNA polimeraz enzimi ) ısıya dayanıklı olduğundan polimeraz zincir reaksiyonunda ( Pcr) kullanılır.
Özet:
45 °C ile 80 °C de gelişenler termofılik olarak, 80 °C nin üstündekiler hiper termofılik olarak adlandırılır. Bunlar kaynayan sıcak sularda, denizin dibindeki hidrotermal deliklerde yaşarlar. Bunlar da ısıya dayanıklı makromoleküller vardır. Mezofıller optimum üreme sıcaklığı 25°C-45°C dir. Doğadaki mikroorganizmaların çoğu mezofiliktir..
Böylece mikroorganizmalar ısıya göre ,
1) Psikrofilik
2) Termofılik
3) Hiper termofılik
4) Mezofılik olmak üzere dört gruba ayrılır.
c. Ortam reaksiyonunun (pH) etkisi
Düşük pH'da yaşayanlar asidofılikler olarak adlandırılır. Thiobacillus sulfide ve Thermoplazma örnek olarak verilebilir. Thiobacillus ferroxidans ve Sulfolobus sulfide (H2S) mineralini okside ederler ve sülfürik asit üretirler. Asidofiliklerde pH nötüre yaklaşınca sitoplazmik membran çözülür ve hücre erir. En asidofilik prokaryot Picrophilus oshimae dir. 60 °C gelişen termofılik bir bakteridir ve pH 0.7 gelişir. pH 10-11 arasında gelişenler ise alkalofiliklerdir. Soda, göllerde ve yüksek karbonatlı alanlarda bulunurlar. Çoğu Bacillus türüne aittir. Aşırı alkalofikler hem de halofıliktir. Bazı alkalofılikler hidrolitik enzimler, lipazlar üretirler ve ev deterjanlarında kullanılırlar. Alkalofılik Basilluslarda Na+ yükü (gradienti) taşıma ve hareket için enerji üretir (Aslında bunu proton motif kuvvetle diğer bakterilerde yapar). Fakat bu bakterilerde proton motif güç ATP sentezinin sonunda yapılır. Bu bakterilerde iç pH ise nötraldir. Dış pH asidiktir. Hücre içinde makromoleküller ancak nötral pH'da aktiftir. Asit pH'da yapı bozulur. Nötrofılik organizmalar ise pH 6-8 de yaşarlar.
Tampon (Buffer);
Mikroorganizmalar besiyerinde üredikleri zaman metabolik reaksiyonları sonucunda asitik veya bazik ürünler oluştururlar. Tamponlar besiyerinde olabilecek pH değişimlerini önlemek amacı ile besiyerine ilave edilirler ve pH sabit kalır. Böyle pH tamponları genellikle çok dar pH oranlarında çalışırlar. Bu sebepten farklı pH değerlerinde farklı tampon kullanılmalıdır. Nötral pH’ ta KH2PO4.
Mikrobiyal Gelişme Üzerine Ozmotik Etkiler:
Mikroorganizmaların gelişmesini etkileyen diğer önemli faktör ise su ve su mevcudiyetidir. Su mevcudiyeti çevrede bulunan suyun ve su da çözünmüş olan şeker, tuz gibi erir maddelerin konsantrasyonuna da bağlıdır. Çünkü bu erir maddelerin suya karşı ilgileri fazladır. Su bunlarla birleştiğinden ortamda mikroorganizmanın faydalanacağı su kalmaz.
d. Nemin Etkisi:
Su aktivitesi:
Bir maddedeki susun nispi mevcudiyetinin ifadesidir. Saf suyun aktivitesi l'dir. Mikroorganizmalar için mevcut olan suyun miktarı ortama şeker ve tuz katıldığında azalır. Yani su aktivitesi gıdanın yüzeyinde mikroorganizmanın kullanabileceği sudur. Bağıl nem ortamın nemidir. 1-100 oranında değişir su aktivitesi ise 0-1 oranında değişir. Su aktivitesi osmo'tik basınçla ters orantılıdır. Eğer ortam yüksek osmotik basınca sahipse ortamın su aktivitesi düşüktür. Mikroorganizmalar düşük su aktiviteli ortamda ancak içlerindeki erir madde konsantrasyonunu arttırarak yani içlerini daha hipertonik yaparak dışarıdan su çekerler. Bu amaçla bakteriler kolin, prolin, glutamik asit ve diğer amino asitleri ya dışarıdan taşır ya da kendisi sentezler. Mantarlar ve algler ise arabitol, gliserol, mannitol gibi poli alkolleri veya sukroz biriktirerek dışarıdan su çekerler. Poli alkoller ve amino asitler hücreye zarar vermezler. Halofilik bakterilerde K+ ve glycine betaine bu rolü görür. Aşırı halofilik bakteride ise ectoine'.dir. Bunlara compatible solute denir(iç yoğunluğu artıran erir madde)
e. Osmotik Basıncın Etkisi
Su, su konsantrasyonu çok olan yerden (düşük erir maddeli) daha az konsantrasyonu olan bölgeye gider ( fazla erir madde konsantrasyonlu) bu olaya osmosis denir.
Halofiller:
Tuzlu ortamlarda yaşayan bakterilerdir. Tuzsuz ortamlarda gelişemezler. Az derecede halofıllikler (%l-6 NaCl), orta derecede halofılikler (%6-15 NaCl) ve aşın halofılikler( %15-30 NaCl) olmak üzere üç gruba ayrılırlar. Tuza toleranslı olan mikroorganizmalar ise hem tuzlu ortamda hem de tuzsuz ortamda gelişebilen mikroorganizmalardır. Yüksek şeker içeren ortamlarda gelişenler ise “osmofiller” olarak adlandırılır. Kuru ortamlarda gelişenler ise kserofiller dir.
Özet:
Bakterinin gelişeceği ortamdaki erir madde oranı arttıkça ortamdaki su oranı azalır (reçeller, turşular gibi). Mikroorganizmalar içlerinde compatible maddeler sentezleyerek iç yoğunluklarını dışarı ortamlardan daha yoğun yaparlar ve bu durumlarda da dışarıdan su çekebilirler. Bazı mikroorganizmalar düşük su potansiyellerinde bazıları ise yüksek oranda tuz içeren ortamlarda gelişirler.
Moleküler Oksijenin Etkisi
Mikroorganizmalar O2 ihtiyaçlarına göre aşağıdaki gibi gruplandırılırlar;
l. Aeroblar: %21 0ksijen'de gelişirler ve çoğu daha fazla O2 ortamlarda ( hyperbarik oksijende) gelişirler.
2. Mikroaerofilikler: %17 O2 de gelişenler. Oksijen miktarı havadakinden daha az Olduğunda gelişirler. Oksijenle yapısı bozulan enzimlere sahiptirler.
3. Fakültatifler: Hem aerobik hem de anaerobik koşullar altında gelişenler.
4. Anaeroblar: Son elektron alıcı olarak O2’ yi kullanacak solunum sistemi olmayanlar anaerobik organizmalardır.fakat iki tip anaerobik organizma.vardır.
1)Aerotolerant anaeroblar: O2'nin varlığında gelişebilenler ve O2'ye toleranslı olanlar.
2)Zorunlu anaeroblar: O2 ile öldürülenler.
Zorunlu anaeroblar oksijen metabolizmasının bazı ürünlerini detoksifiye edemediklerinden ölürler. Oksijen indirgendiğinde hidrojen peroksit (H2O2), superoksit (O2-) ve hidroksil radikalleri (OH-) oluşturulur. Zorunlu anaeroblarda flavin enzimleri vardır. Bu da O2 ile kendiliğinden reaksiyona girerek bu toksik ürünleri üretir. Aeroblarda bu toksik oksijen ürünlerini ortadan kaldıracak enzim sistemleri vardır.
Mikroorganizmaların Çoğalması
Mikroorganizmalar genel olarak ikiye bölünerek ya da tomurcuklanarak çoğalan organizmalardır. Hücre ikiye bölünerek çoğalmadan önce hücre boyutça iki katına çıkar. Sitoplasmik membran ve hücre duvarı içeri doğru çöker septum oluşur. Bölünme esnasında tüm hücresel içerik de iki katına çıkmıştır. Bölünme sonunda her bir yavru hücrede tam bir kromozom, diğer makromoleküller, monomerler ve inorganik iyonların yeterli kopyası mevcuttur. Bakterilerde generasyon süresi (iki bölünme arasındaki zaman) her bakteri için değişik olabilir. Bu hem besinsel hem de genetik faktörlere bağlıdır.
Populasyon Büyümesi:
Büyüme populasyondaki mikroorganizma sayısındaki artışı ifade etmek için kullanılır. Büyüme oranı her birim zamanda hücre kitlesinde veya hücre sayısındaki değişmedir. Hücre bölünme siklusunda hücrenin tüm yapısal kompenentleri iki katına çıkar. Bir hücreden iki hücre oluşması için geçen zaman generasyon süresi olarak adlandırılır. Böylece generasyon süresi hücre populasyonunun iki katına çıkması için gereken zamandır. Generasyon süresi türler arasında değişir. Genelde 1-3 saat arasında değişir. Bazı bakterilerde ise 10 dakika bazılarında ise bir kaç saat, hatta 24 saatten fazla da olabilir.
Eksponensiyel Büyüme;
Hücre sayısının her birim zamanda iki katına çıkması eksponensiyel gelişme olarak adlandırılır. Bir deneyden elde edilen hücre sayıları y ekseninde, geçen zaman ise x ekseninde gösterildiğinde aritmetik bir eğri elde edilir. Elde edilen bu düz doğru mikroorganizmaların eksponansiyel olarak geliştiğini göstermektedir.
Büyüme Eğrisi;
Kapalı bir sistemdeki bakteri büyümesini incelediğimizde 4 farklı safha görürüz;
l. Lag fazı: Mikroorganizmalar taze bir besiyerine ekildiğinde gelişme hemen başlamaz hücre yeni besiyeri koşullarına uyumluluk göstermek için bir adaptasyon döneminden geçer. Bu safhaya lag fazı adı verilir. Bu safhada hücreler fizyolojik olarak aktiftir. DNA'da artış yok. Toplam protein ve RNA'da artış vardır. Enzim sentezi var, hücre sayısında artış yoktur. Lag fazı aşağıdaki durumlarda görülür;
l. Eğer kültür durma fazından veya eski kültüründen alınmış ise lag fazı görülür.
2. Hücreler ısı, radyasyon veya toksik kimyasallarla muamele gördükten sonra aynı taze bir
ortama ekilirlerse lag fazı görülür. Çünkü bu hücrelerin kendisini tamir etmesi için zaman
gerekir.
3. Zengin bir besiyerinden alınan mikroorganizma az içerikli bir besiyerine ekilirse lag fazı
görülür.
Log üreme fazından mikroorganizmalar alınıp aynı içerikli taze bir ortama ekilirse lag fazı
görülmez.
Log Üreme Fazı:
Mikroorganizmaların geometrik artış gösterdikleri fazdır. Mikroorganizma sayısı matematiksel olarak üst cinsinden arttığı faza logaritmik üreme fazı ya da kısaca log fazı denir. Bu fazın gelişme oranı ısı, besiyerinin kompozisyonu, mikroorganizmanın genetik karakteri ile değişir. Daha sonra kesikli kültürde mikroorganizma üremesine bağlı olarak besiyerinde besin maddeleri tükendiğinden, metabolik etkinlik sonucu ortamda toksik maddeler biriktiğinden, ortam pH'ı gibi ortam koşullan değiştiğinden ve O2 bittiğinden üreme durarak durgunluk fazına girer (stationary faza).
Durgunluk Fazı;
Bu fazda üreyen mikroorganizmalarla, ölen mikroorganizma sayısı aynı olduğundan toplam hücre kütlesi zamana bağlı olarak değişmeden kalır.
Litik Faz;
Durgunluk fazının sonunda besiyerindeki canlı hücre sayısı veya hücre kitlesinin zamana bağlı olarak azaldığı gözlenir. Bu son safhaya litik faz denir. Safhalar bir organizmaya değil tüm hücre populasyona aittir.
Kemostat:
Hücreler uzun süre sabit çevrede tutulmak istendiğinde devamlı kültür tekniği kullanılır. Burada sabit bir haçimde taze besiyeri ortama sürekli olarak ilave edilir. Yine aynı hacimde besiyeri ortamdan devamlı uzaklaştırılır. Böyle bir sistem dengededir. Bu sistemde hücre sayısı ve besin durumu sabittir. Sistem ise sabit sistem( sfceady system) denir. Devamlı kültür aletine kemostat denir. Bu alet hem kültürün populasyon yoğunluğu hem de kültürdeki büyüme oranını kontrol eder. Dilüsyon oranı, karbon ve azot kaynağı gibi sınırlı besin konsantrasyonu kemostat kontrolünde kullanılır.
Bu alette populasyon yoğunluğu reservuarlarda bulunan sınırlı besinin konsantrasyonu ile kontrol edilir. Büyüme oranı ise akış oranı ile kontrol edilir. Bu akış oranı (besiyerine ilave edilen taze besiyeri oranı ) ve besiyerindeki madde miktarı ayarlanabilir. Kemostatdaki hücre yoğunluğu (hücre/ ml) ortamdaki sınırlı besin seviyesi ile kontrol edilir.
Özet:
Mikroorganizmalar taze bir kültüre ekildikleri zaman karakteristik gelişme eğrisi gösterirler. Bu eğride lag başlangıç fazı, mikroorganizmaların üredikleri dönem log fazı, besinlerin bittiği toksik ürürlerin üretildiği gelişmenin durduğu durgunluk fazı ve mikroorganizmaların giderek öldüğü dönem litik fazdır. Devamlı kültür aleti (kemostat)uzun süre boyunca hücre populasyonunu log. üreme fazında tutar. Kemostat da kültürün sulandırma oranı büyüme oranını kontrol eder. Populasyon boyutu da kapalı sisteme giren gelişmeyi sınırlayan besin miktarı tarafından kontrol edilir.
1. Lag fazında ne olmaz?
2. Hücreler neden durgunluk fazına girer?
3. Hangi fazda gelişme matematiksel olarak ifade edilebilir?