patogenicidad y virulencia bacteriana"
Pontificia Universidad Católica de Chile
Licenciatura en Biología
La envoltura externa en bacterias Gram negativas está compuesta por 3 capas: membrana interna, cercana al citoplasma; el peptidoglicán y la membrana externa (1,2). Esta última, ampliamente estudiada, está compuesta por 2 tipos de lípidos (lipopolisacáridos o LPS y fosfolípidos), así como proteínas muy características; y en Enterobacteriaceae un polisacárido único: el antígeno enterobacterial común (ECA, por sus siglas en inglés) (3).
La membrana externa es la interfase entre la bacteria y el medio que la rodea; constituyendo una importante barrera contra agentes que le pueden ser perjudiciales, tales como compuestos químicos tóxicos, antibióticos y detergentes (4). Se ha visto que es poco permeable al flujo de compuestos altamente lipofílicos, en un factor entre 50 a 100 en comparación con la membrana citoplasmática (3). Sin embargo, se ha constatado que moléculas hidrofílicas de masa molecular no mayor a 700 daltons la atraviesan en forma pasiva e inespecífica. La explicación a este fenómeno se debe a proteínas presentes, denominadas porinas, por su capacidad de formar poros de difusión transmembranosos (4).
Las membranas externas de Escherichia coli y Salmonella typhimurium, a las cuales se les han realizado variados estudios, poseen entre 10 y 20 proteínas de cualidades distintas (4), tales como la proteína OmpA (outer membrane protein A) de aproximadamente 35 kD en E. coli K-12, y las porinas clásicas OmpF (~ 37 kD), OmpD (~ 38 kD) y PhoE (~ 36 kD), todas presentes en E. coli K-12 y S. typhimurium LT2 a excepción de OmpD, la cual solo se encontraría en S. typhimurium (3,4).
En condiciones usuales en medio de cultivo solo las porinas OmpF y OmpC (además de OmpD en S. typhimurium) son producidas, pero su abundancia relativa está regulada eficientemente por señales medioambientales, tales como osmolaridad (3). Se ha establecido claramente que E. coli altera recíprocamente los niveles de expresión de sus porinas: OmpF es expresada preferentemente cuando la osmolaridad del medio externo es baja, mientras que OmpC lo es en condiciones opuestas (4). Todos estos datos hacen suponer de inmediato el rol que jugarían las proteínas de membrana externa en la patogenicidad y virulencia de las bacterias.
A principios de los años 80 se había identificado el operon ompB, que está constituido por 2 genes: ompR y envZ, proponiéndose que EnvZ actúa como un sensor medioambiental y transmite señales a OmpR, el cual modularía la transcripción de varios genes. Los genes dependientes de OmpR incluyen los que codifican las porinas OmpC y OmpF, siendo la expresión de OmpD independiente (5).
Dorman y colegas se propusieron crear mutantes ompR en cepas virulentas de S. typhimurium, con el fin de verificar el efecto que tendría esta mutación, así como en los genes estructurales de ompC, ompD y ompF. Los resultados de ellos mostraron que una mutación en el gen ompR tiene un efecto dramático en la virulencia de S. typhimurium en ratones BALB/c. incrementándose la dosis letal 50% (LD50) por más de 3 unidades logarítmicas comparados con la cepa silvestre. Además, ellos reportaron que las cepas que contienen mutaciones en ompC o ompF fueron tan virulentas como las cepas silvestres, mientras que la que contiene una mutación en ompD mostró una drástica reducción de su virulencia (LD50 se incremento 23 veces entre la mutante ompD y la cepa silvestre) (5). Este estudio asigna así un importante papel a la porina OmpD en la virulencia de S. typhimurium.
Sin embargo, Meyer et al en 1998 se propusieron corroborar los resultados anteriores, y las conclusiones obtenidas fueron inquietantes: ellos encontraron que no existirían diferencias estadísticamente significativas en las capacidades de adherencia e invasión entre la cepa silvestre de S. typhimurium y su correspondiente mutante en ompD. Mas aún, la LD50 y estudios de colonización revelaron que tampoco habría diferencias estadísticas en la virulencia de S. typhimurium silvestre y su correspondiente mutante ompD (6). Estos resultados contradicen enormemente al equipo de Dorman et al. Cabe eso si mencionar algunas salvedades: ambos estudios trabajaron con cepas distintas de S. typhimurium, y mas importante aún, hay una diferencia en la recolección de datos en cuanto a los días postinfección de los ratones, ya que Meyer et al llegan hasta el dia 6 luego de la inoculación, mientras que Dorman et al realizan el estudio hasta 2 semanas después de la administración oral de las cepas silvestres y mutantes de S. typhimurium. Surge entonces un pero que debe ser investigado, debido no solo a las implicancias "extra" científicas que surgen por la diferencia en los resultados, sino porque además se abre una interrogante sobre el verdadero papel de OmpD en la virulencia; mas aun si pensamos que S. typhi no posee esta porina, y si efectivamente OmpD tiene un efecto en la virulencia no se explicaría que S. typhi no la posea.
Escherichia colies la bacteria Gram negativa que más comúnmente causa meningitis en el periodo neonatal. Es bien sabido que la existencia de la barrera hematocefálica es efectiva en el paso de diversas sustancias, como medicamentos, y por cierto de bacterias. Sin embargo E. coli la atraviesa, estando poco claro que factores median este paso. Por ello Prasadarao et al en 1996 estudiaron el rol en E. coli K1 que jugaría OmpA. Los resultados arrojaron que había una diferencia entre 25 a 50 en la capacidad de invasión de células endoteliales microvasculares de cerebro entre las cepas silvestres y la mutante OmpA- , siendo mayor para la silvestre. Al complementarse la mutación en el gen ompA la cepa recuperaba los niveles de invasividad de la cepa OmpA+ (7). Así pues OmpA es la primera estructura identificada en realzar la invasión de E. coli en células endoteliales microvasculares de cerebro, un importante evento en la patogénesis de meningitis causada por esta bacteria.
Bernardini y colegas en 1993 investigaron el rol de OmpC en la virulencia de Shigella flexneri. OmpC es altamente expresada independientemente de si la bacteria crece en un medio de alta o baja osmolaridad. Esta continua expresión contrasta con la regulación que se observa en E. coli, donde OmpC es reprimida por una baja osmolaridad e inducida por alta osmolaridad. Mediante estudios con mutantes delta de los genes que regulan esta porina (ompR y envZ), y mutantes delta del gen ompC, ellos observaron que los 2 tipos de mutantes tuvieron una reducida virulencia, comparados con la cepa silvestre. Asimismo, mutantes en el gen ompF no mostraron efecto alguno en la capacidad de invasión de la bacteria tanto in vivo como in vitro al compararla con la cepa silvestre (8). He aquí una diferencia con lo que ocurre con Salmonella typhimurium, donde OmpC aparentemente no ejerce un rol en la capacidad de invadir células, por lo menos in vitro, aunque, como se verá a continuación, si tiene importancia en otros aspectos relativos al proceso de infección y respuesta inmunológica.
La introducción de un plasmidio multicopia que contiene el gen ompC clonado de E. coli bastó para que se recobrara la virulencia, lo que indica que esta proteína es suficiente y necesaria para producir virulencia en una mutante de S. flexneri (8).
Los estudios sobre la regulación de la síntesis de porinas en bacterias entéricas muestran que prácticamente ninguna porina OmpF se sintetiza a 37ºC en presencia de 0.15 M de NaCl, que precisamente son las condiciones presentes en el interior del cuerpo de los mamíferos. Esto sugiere que OmpF es probablemente beneficiosa para la bacteria cuando se encuentra fuera del cuerpo animal, dado que su canal es mas amplio que OmpC (3). Así pues OmpC podría tener un rol mayor en algún aspecto relacionado con la respuesta inmunológica del cuerpo sobre la bacteria, dado que se descarta un efecto de esta porina en la virulencia (véase mas arriba).
El efecto inmunogénico de OmpC durante la fiebre tifoidea en humanos fue evaluado in vitro por Luz Blanco et al en el año 1997. Ellos encontraron que la inmunización in vitro con antígeno OmpC activó en mas de la mitad de los pacientes la capacidad bactericida de monocitos U937, actividad que es reducida si la inmunización se realiza con preparaciones de membrana externa de S. typhi que carecen de OmpC (9).
Por otro lado en 1999 Pistole y Negm, usando mutagénesis por transposición para crear mutantes deficientes en OmpC en cepas virulentas de S. typhimurium mostraron diferencias 5 veces mayores para la cepa silvestre en la adherencia y asociación con macrófagos. Es mas, la internalización de la bacteria por parte de los macrófagos fue 40 veces mayor para la cepa silvestre que para la mutante OmpC-. Un análisis del gen ompC en las cepas probadas contenía discretas diferencias comparadas con el mismo gen en Salmonella typhi y Escherichia coli , siendo mas idéntica para la primera (98%, comparado con E. coli = 77%) (10).
Estos resultados me llevaron a pensar de inmediato que ocurriría si por algún motivo OmpC se perdiera, salvando eso si el problema de la no síntesis de OmpF. ¿Podría OmpD suplir en rol de una mutante OmpC, y por ende aumentarse la virulencia, dado que OmpC es la reconocida por los macrófagos? Esta interrogante no pudo ser satisfecha al revisar los trabajos publicados, pero ciertamente merece una consideración, mas aún si volvemos a retomar el papel de OmpD en S. typhimurium.
La proteína de membrana externa integral X (OmpX) de E. coli proviene de una familia altamente conservada de proteínas que promueven la adhesión y entrada de la bacteria a las células de mamíferos. Estas proteínas tiene un rol en la resistencia en contra del ataque del sistema de complemento humano. Estudios de su estructura cristalina realizados por Vogt et al en 1999 muestran que tiene una misma topología beta-plegada de OmpA, aunque hay diferencias en el numero de puentes de hidrógeno internos y su disposición (11).
El gen que codifica la proteína de membrana externa mayor (MOMP, por sus siglas en inglés) de 25 kD de Legionella pneumophila fue transformado en E. coli JM 83, y el clon resultante mostró en ensayos de invasividad y unión a monocitos U-937 un incremento de 5 veces en la unión independiente de la opsonización. Además, la incorporación del gen por electroporación a una cepa de Legionella pneumophila de virulencia baja y cuya expresión de MOMP estaba reducida pero realzada la expresión de una OMP de 31 kD; mostró que la expresión de OMP de 31 kD se suprime al mismo tiempo que se reestablece la virulencia en embriones de pollo, sugiriéndose un rol de MOMP de 25 kD de Legionella pneumophila en la adhesión molecular y su rol en la virulencia en embriones de pollo (12).
Black, Jacqueline G; Microbiology, Principles and Applications. 1993, 2º edición. Prentice Hall, Inc. Páginas 78-82.
Nikaido, H. 1996 Outer membrane, pags. 29.47 en F. C. Neidhardt et al. Escherichia coli and Salmonella: celular and molecular biology. ASM Press, Washington, D.C.
Mora L., G; Porinas en enterobacterias. 1988, Acta Microbiol. 1(2): 9-20.
Dorman, Charles J. et al; Characterizations of Porin and ompR Mutants of virulent straint of Salmonella typhimurium: ompR Mutants are attenuated in vivo. July, 1989, Infect. Inmun. 57 (7): 2136-2140.
Meyer, Paul N. et al; Virulence of a Salmonella typhimurium OmpD mutant. Jan, 1998, Infect. Inmun. 66 (1): 387-390.
Prasadarao, N. et al; Outer membrane protein A of Escherichia coli contributes to invasion of brain microvascular endotelial cells. Jan, 1996, Infect. Inmun. 64 (1): 146-153.
Bernardini, M.L; OmpC is involved in invasion of epithelial cells by Shigella flexneri. Sep, 1993, Infect. Inmun. 61 (9): 3625-3635.
Blanco, Luz P. et al; Salmonella typhi Ty2 OmpC porin induces bacterial activity on U937 monocytes. 1997, Microbiology and Inmunology 41 (12): 999-1003.
Negm, R.; Pistole, T.; The porin OmpC of Salmonella typhimurium mediates adherence to macrophages. Aug, 1999, Canadian Journal of Microbiology 45 (8): 658-669.
Vogt, J.; Schulz, G; The structure of the outer membrane protein OmpX from Escherichia coli reveals possible mechanisms of virulence. Oct, 1999, Structure London 7 (10): 1301-1309.
Krinos C, et al; Role of the 25 kDa major outer membrane protein of Legionella pneumophila in attachment to U-937 cells and its potential as a virulence factor for chick embryos. Feb, 1999, Journal of Applied Microbiology 86 (2): 237-244.
