UN
GEL DE CELULOSA DESARROLLADO PARA LA DETERMINACION DE POLISACARIDOS
Ramos
E. L.1, Ravelo S.,
Bordallo E.2 y León V.
1.
Instituto Cubano de Investigaciones Azucareras, ICINAZ, Carretera del central M.
Martínez Prieto, Km. 2 1/2 Boyeros, Ciudad de La Habana, Cuba. ramguira@yahoo.com
2.Unión
de Investigación-Producción de la Celulosa del Bagazo Cuba-9. Pablo Noriega
Apdo.: 8, CP: 33500, Quivicán, La Habana, Cuba. e-mail: direcc9@enet.cu
La
capacidad de la filtración por gel para separar moléculas según su tamaño se
fundamenta en el riguroso control del tamaño de los poros de las matrices o geles,
preparados por entrecruzamiento de
diferentes polisacáridos.
Los
azúcares de alto peso molecular, como los polisacáridos, no entran en los
poros del gel por lo que sólo pueden difundir a través de la fase líquida que
se encuentra entre las partículas volumen externo de las partículas del gel y
por consiguiente se eluirán primero al correr la columna. Por el contrario, los azúcares
que poseen un tamaño lo suficientemente pequeño para que puedan penetrar
en los poros se incluyen en la matriz y pueden así estar tanto en la
fase móvil, que está dentro de las partículas del gel como en aquella que las
rodea, retardándose de este modo su salida de la columna. Los de mediano peso
molecular podrán difundirse parcialmente en la fase líquida interna, saliendo
en orden decreciente de su peso molecular. La siguiente ecuación describe este
comportamiento:
La
cromatografía por filtración por gel se ha empleado por más de 40 años y
puede usarse para: a) la separación de mezclas complejas de polisacáridos o
proteínas; b) la eliminación de moléculas de mayor o menor peso molecular que
impurifiquen estas sustancias; c) la desalinización o el cambio de buffer.
Los
geles más usados se preparan por entrecruzamiento de dextranas o agar, aunque
la celulosa se ha empleado también con este fin, obteniéndose un amplio
espectro de porosidades en las matrices obtenidas. Estos tipos de geles se
producen y comercializan por varias firmas.
En
la industria azucarera es imprescindible contar con este tipo de cromatografía
dada la necesidad de conocer los niveles de concentración de varios polisacáridos
que son extremadamente dañinos para la fábrica de azúcar, los que disminuyen
la eficiencia y la calidad de los azúcares que se producen. Dentro de estos
polisacáridos las dextranas sobresalen por su vinculación a las pérdidas de
sacarosa por deterioro de la caña
y sus jugos, entre el corte y la molida . Estos polisacáridos
elevan la viscosidad de los productos intermedios de la fábrica (mieles y
masas) retardando la velocidad de cristalización y diminuyendo el tamaño medio
de los cristales de sacarosa.
La
filtración por gel permite separar con alta capacidad y rapidez el grupo de
compuestos formado por polisacáridos de aquel otro constituido por azúcares de
bajo peso molecular como la sacarosa, otros oligosacáridos y los monosacáridos
(glucosa y fructosa, principalmente).
Durante
años en el instituto de investigaciones Cuba 9 se ha venido trabajando en el desarrollo de geles a partir de la
celulosa, preparándose geles con partículas esféricas de diversos diámetros
(30-250 µm) que cubren un amplio espectro de porosidades en función de las
condiciones de su preparación, productos que se conocen bajo el nombre
comercial de CELEF. En este trabajo se estudia la factibilidad del
empleo de estos geles para la determinación de polisacáridos en los productos
de la industria azucarera, de manera de que se
pueda contar con una fuente nacional de estos materiales cromatográficos,
que son imprescindibles para el control de la calidad de la caña y sus
productos.
La cromatografía de filtración por gel para la separación de grupos de moléculas o para la desalinización no discrimina entre las moléculas de bajo peso molecular o las de alto peso molecular permitiendo sólo la separación de los dos grupos de moléculas de diferentes tamaños, es por ello que se pueden usar columnas pequeñas, gruesas y altos flujos sin pérdidas de resolución. No obstante, su uso analítico obliga a evitar cualquier solapamiento entre los azúcares de diferente peso molecular, pues introduciría serias interferencias en la determinación de polisacáridos en soluciones que son naturalmente de muy altos contenidos de sacarosa.
En la Figura 2 se compara dos de las mejores variantes obtenidas del gel CELEF, resultando evidente que el CELEF 3 posee las mejores propiedades para la determinación de dextranas, ya que se logra la mayor separación entre las dextranas y la sacarosa, con mezclas que contienen una proporción de estos azúcares semejante a la de los jugos.
Para determinar el peso molecular mínimo en que las dextranas son excluidas totalmente de la matriz del gel se realizaron separaciones de dextranas de diferentes peso molecular. Como se observa en la Figura 3, las dextranas con peso molecular mayor de 5000 ua salen en el volumen de exclusión de la columna. Según este resultado el Gel CELEF-3 resulta comparable en sus propiedades con las del Gel Sephadex G-25, gel que se usa normalmente para la desalinización de biopolímeros.
En las Tabla I y II se presenta un estudio estadístico de los resultados obtenidos al comparar el nivel de dextranas en muestras de jugo y azúcar crudo usando columnas de dimensiones similares de Sephadex G-50 y CELEF-3, como se observa no existen diferencias significativas en los valores obtenidos por ambas vías para cada producto. Estos resultados indican que puede usarse el Gel CELEF-3 para la determinación de dextranas en los productos de la industria, cubriéndose un amplio espectro de valores de la relación dextranas / sacarosa (0.1- 2 % sacarosa) en los productos, sin presentarse diferencia significativa entre los resultados obtenidos usando ambos geles.
Se
ha desarrollado, producto de la colaboración de especialistas de los
Institutos Cuba- 9 e ICINAZ, un gel de celulosa nombrado CELEF-3, que
cumple con todos los requisitos para usarse en la determinación de
polisacáridos en los productos de la industria azucarera.
El
gel desarrollado es equivalente al Sephadex G-25 en sus propiedades, al
excluir las dextranas con PM mayor de 5000 ua.
No se observa interferencia de la sacarosa, ni diferencias significativas en los resultados de la determinación de polisacáridos en azúcares crudos por filtración por gel usando columnas de dimensiones similares de Sephadex G-50 y CELEF-3.
Una versión completa de este trabajo será publicada próximamente, vea nuestras publicaciones aquí!