BBP Laboratory. Genetic diversity course DESA

MARQUAGE BIOCHIMIQUE ET MOLECULAIRE DES OBTENTIONS DE LA CULTURE DES TISSUS DES PLANTES

La culture in vitro reste un moyen de multiplication végétative extrêmement puissant. Un (1) seul méristème peut permettre d’obtenir, en une année de l’ordre de un million (10⁶) de vitro-plants. Cependant, il est encore difficile de reconnaître facilement le matériel végétal en tube. Les premières précautions à prendre est d’éviter tout risque d’erreurs dans les variétés lors du prélèvement du méristème originel.

A l’exception de la culture d’anthères ou d’ovules pour l’obtention d’individus haploïdes (origine = méiose), les autres méthodes de micropropagation (micro-bouturage et culture de méristèmes, tissus, cellules et protoplastes) impliquent des divisions cellulaires non réductrices du pool chromosomique (mitoses). Ainsi, pour chaque cycle mitotique on aboutit à 2 cellules filles, théoriquement identiques à la cellule mère.

Bien que rares (fréquence = 10^-6), des mutations peuvent naturellement se produire et permettre, ainsi, l’évolution à l’échelle du temps. Des variations génétiques ou physiologiques pourraient avoir lieu au cours des différentes phases de la culture in vitro. On se demande si les conditions de culture in vitro sont susceptibles de modifier la fréquence des mutations ou d’ajouter d’autres causes de variations.

La variabilité engendrée par la culture in vitro est de deux ordres :
- Une variabilité non voulue pour la multiplication conforme de clones.
- Une variabilité voulue pour l’obtention de nouveaux génotypes.

La variabilité non voulue reste un obstacle pour la multiplication conforme. En effet, celle ci doit assurer une stabilité génétique du matériel in vitro. Le domaine où cette condition est capitale est celui de la conservation des ressources génétiques, car, la mondialisation de l’agriculture s’accompagne de la disparition de certaines espèces et d’un grand nombre de variétés. Beaucoup de laboratoires expérimentent la conservation in vitro de nombreuses espèces à l’état de vie ralentie, dans des conditions de température -1°C à +5°C, selon les espèces. Ceci rentre dans le cadre de conservation ex-situ des ressources génétiques. Après un délai d’environ un an, il faut procéder à un repiquage sur milieu neuf.

La variabilité des plants néoformés à partir de tissus ou de cellules cultivées in vitro a comme causes une modification du nombre de chromosomes, une mutation génique ou cytoplasmique ou un changement durable du mode de fonctionnement du génotype

Les variations chromosomiques en culture in vitro (nombre de chromosomes) se produisent principalement dans la culture de cals indifférenciés ou les cultures cellulaires, tandis que les cultures de méristèmes conduisent à des plantes uniformes.

Les mutations géniques peuvent conduire, après culture in vitro, à l’apparition de phénotypes nouveaux, sans changement du nombre de chromosomes. Ce sont des ‘variants’.

Les modifications épigéniques ou physiologiques peuvent concerner plusieurs caractères phénotypiques, comme la forme, la couleur des feuilles, ainsi que leur nombre et leur poids. Ces modifications, ne concernant pas le nombre de chromosomes, peuvent se traduire, également, par l’altération de la floraison, de l’expression du sexe, de la fertilité et du rendement. La majorité de ces comportements physiologiques sont de courte durée et peuvent résulter des chocs chimiques et physiques subit par le tissu en culture in vitro. Néanmoins, certains développements anormaux peuvent être mémorisés longtemps.

3. MARQUAGE BIOCHIMIQUE ET MOLECULAIRE DES OBTENTIONS DE LA CULTURE IN VITRO.

En considérant l’asynchronie de la culture des tissus, le nombre de cellules impliquées dans le processus de la régénération est toujours très faible par rapport au nombre total des cellules de l’explant ou de la suspension cellulaire, surtout pendant les premières phases de la régénération. Les études biochimiques et moléculaires concernent, souvent, la totalité du matériel. De ce fait, ces études doivent être accompagnées d’analyses de natures microscopiques et histochimiques.

Plusieurs auteurs ont rapporté une amplification précoce du DNA, survenant 1-20 heures après introduction en culture chez les dicotylédones. Cette étape est suivie par une activité mitotique pouvant être reliée à une dédifférenciation. Aux stades plus avancés, le contenu en DNA diminue à environ 50% du contenu cellulaire. Il a été montré, aussi, que le DNA répété est fortement réduit pendant la phase linéaire de la croissance des cals chez la carotte. Pendant la phase de croissance stationnaire (4 semaines de culture) des amplifications abondantes du DNA ont été, de même, montrées chez la même espèce.

D’autre part, plusieurs études ont montré que le stade de dédifférenciation cellulaire est lié à une méthylation du DNA. Contrairement à la phase de croissance stationnaire du cal de carotte, la phase de croissance linéaire est caractérisée par une augmentation de la méthylation du DNA. D’autres travaux rapportent l’effet inducteur de la méthylation du DNA par l’auxine, comme hormone de croissance. Par contre, la kinétine tend à bloquer les changements dans la méthylation du DNA. Cette dernière est considérée, donc, comme marqueur de la dédifférenciation cellulaire.

Des changements typiques dans l’expression des gènes ont été rapportés pendant les stades précoces de la différenciation. Des corrélations ont été trouvées entre le taux des glycoprotéines sécrétées dans le milieu de culture et la différenciation des embryons somatiques.

Plusieurs enzymes ont été décrites comme marqueurs de plusieurs phases de la régénération. Ainsi, les peroxydases sont utilisées pour le marquage de l’enracinement et l’embryogenèse somatique. Les estérases pour différencier les cals embryogènes et non embryogènes et les polyphénoloxydases pour l’embryogenèse en suspensions cellulaires.

* Apparition de grains d’amidon de courte durée pendant les étapes précoces de la régénération des tiges et des embryons somatiques.
* Fluctuation du niveau d’AIA endogène pendant le processus d’enracinement.
* Augmentation des niveaux de polyamines (putrescine et spermine, en particulier) chez les cellules embryogènes et leur milieu de culture. L’inhibition de la réduction de la synthèse des polyamines réduit le nombre d’embryons. Leur addition restaure la formation d’embryons somatiques.
* Diminution du taux de l’éthylène et du glutathion chez les suspensions cellulaires embryogènes.
* Diminution de l’état redox (aptitude à la réduction du Fe³⁺) chez les cellules embryogènes
* Utilisation des contenus phénoliques comme marqueur de l’aptitude à la formation de racines.

Trois types de cals sont obtenus lors de la culture des tissus chez le palmier dattier (Phoenix dactylifera L.).

Les vitro-plants de fraisier issus de plusieurs cycles de multiplication in vitro (High Number of Subcultures, HNS) produisent de façon anormale, un nombre élevé de fleurs par inflorescence, une fois comparés aux plants propagés de façon conventionnelle ou ceux issus de culture in vitro avec une faible fréquence de repiquage (Low Number of Subcultures, LNS) (Jemmali et al., 1995. J.Plant Physiol. 147, 435-440).

- Croissance limitée.- Dépôt réduit de la cire épicuticulaire.- Activité peroxydasique élevée.

Vitro-plants LNS-LNS

(du haut vers le bas)

Vitro-plants HNS-LNS

(du haut vers le bas)

Multiplication in vitro : 7 subcultures + 1 cycle d’enracinement.

Multiplication in vitro : 58 subcultures (HNS) + 1 cycle d’enracinement.

Vitro-plants LNS cultivés au phytotron ( 8 générations par stolons.

FLORAISON NORMALE

Vitro-plants HNS cultivés au phytotron ( 8 générations par stolons.

FLORAISON ANORMALE

Multiplication in vitro : 7 subcultures (LNS) + 1 cycle d’enracinement.

Vitro-plants LNS-LNS cultivés au phytotron

FLORAISON NORMALE

Vitro-plants HNS-LNS cultivés au phytotron

FLORAISON ANORMALE

L’hybridation somatique a comme principal inconvénient une faible fréquence d’obtention d’hybrides somatiques. Une fois la fusion réalisée, la perte d’une proportion élevée des produits de fusion survient. En moyenne, 1-5 plantes hybrides peuvent être récupérées sur 1000 hétérocaryons produits.

Une fois des plantes issues de fusion seront obtenues, elles subiront plusieurs analyses de nature cytochimique pour le comptage des chromosomes et de types biochimique et moléculaire pour examiner leur caractère hybride. Dans ce dernier cas, les analyses électrophorétiques suivantes peuvent être réalisées :

* Analyse des protéines et des isoenzymes. * Analyse du DNA mitochondrial, du DNA chloroplastique et de DNA nucléaire.

Il en résulte un état hybride relativement stable après une première élimination de chromosomes. Les plantes sont généralement anormales et stériles.

Dans la majorité, les plantes sont aneuploïdes (fusion cellulaire avec perte de chromosomes aboutissant à une stérilité). Des amphiploïdes peuvent être obtenus. Exemples : Nicotiana glauca + N.langsdorfili; Brassica + Arabidopsis; Petunia hybrida + P.parodii. La majorité des plantes sont stériles, sauf Petunia.

Dans la majorité des cas, on obtient une variation importante du nombre de chromosomes. Néanmoins, on peut obtenir des plantes hybrides symétriques sans perte de chromosomes (exemple : 4n = 2nA + 2nB). Les allotétraploïdes formés par fusion montrent de faibles appariements chromosomiques. Il en résulte une absence de crossing-over et donc absence d’échanges de gènes entre les 2 génomes.