PARTE I: SU PRESENCIA EN LA CAÑA DE AZUCAR

Ramos E. L., Ravelo S., ICINAZ, MINAZ, Muñoz E, del Instituto FINLAY y Pérez C., Facultad de Química, UH.

Palabras claves: trehalosa, caña, azúcar, HYDROMAG, AIS, oligosacáridos

Aquí puede ver la Parte II !

INTRODUCCIÓN

La trehalosa, α-D-glucopiranosil α-D-glucopiranósido, es un oligosacárido no reductor constituido por dos unidades de glucosa unidas por un enlace: α (1-►1). Es particularmente estable al calentamiento y al medio ácido. Se ha aislado de más de 80 especies, que incluyen plantas, algas, hongos, levaduras, bacteria, insectos, y otros invertebrados (Elbein 1974). La treahalosa se sintetiza en un proceso de dos etapas por las enzimas trehalosa 6-fosfato sintasa, TPS, y trehalosa 6-fosfato fosfatasa, TPP, y es degradada por la trehalasa, Goddijn y col., 1999). Ver bibliografia aquí!

En la actualidad aun no se entiende a cabalidad el proceso de regulación de la acumulación de sacarosa en los organismos, implicándose en el proceso de regulación del flujo de carbono en bacterias, hongos y recientemente en las plantas, a varios componentes del metabolismo de la trehalosa. En general se ha propuestos distintas funciones de la presencia de trehalosa: a) como fuente de carbono, b) como un agente protector al estrés (por ejemplo: sequías, salinidad del suelo y estrés oxidativo), y c) como una molécula señal o reguladora del metabolismo y el crecimiento de la planta; así también a su derivado fosfatado en posición 6 se le adjudica propiedades reguladoras de la distribución del carbono. Aunque no parece estar vinculada directamente la trehalosa a la acumulación de sacarosa, pueden estar asociados el 6-fosfato de trehalosa o las enzimas del metabolismo de la trehalosa.

Recientemente, en cinco variedades de caña de azúcar se ha hallado niveles de trehalosa en los entrenudos que varían entre 10^-4-10^-3 mg/gramo de materia fresca, niveles de concentración que no permiten considerar a la trehalosa como fuente de carbono o como un agente protector del estrés. (Bosch, 2005)

Se ha tratado de incrementar el contenido de trehalosa en varias plantas, entre las cuales estan el arroz y la caña de azúcar. Por ejemplo, en el arroz transgénico (logrado expresando genes de fusión de E.coli TPS y TPP) se acumula trehalosa hasta 1 mg/g de su peso fresco. En la caña se ha logrado recientemente introducir el gen de la grifola frondosa trehalosa sintasa, la planta trangénica acumula hasta 8.805–12.863 mg/g de peso fresco (7-10 % de los sólidos en el jugo), lo cual es notable si se compara con las cantidades prácticamente indetectables en la caña no trangénica (Zhang y col., 2006). La caña trangénica obtenida mostró alta resistencia a la sequía, sin alterar sus índices fisiológicos.  No obstante, se desconoce la razón del aumento de tolerancia de estas líneas transgénicas en las que se logra una mayor presencia del disacárido.

Por otra parte, hoy conocemos que la caña luego del corte aumenta su capacidad de formación de diversos oligosacáridos, pudiéndose expresar esta tendencia por el nivel de oligosacáridos en sus jugos, (AISo), en el momento de su madurez o corte. Normalmente el nivel de AISo en las variedades de caña oscila alrededor de 1 % p/p de los sólidos en el jugo, valores mayores (que pueden alcanzar el 10 % de los sólidos) indican una tendencia especial de la variedad de caña a “autodegradarse” o a formar diferentes oligosacáridos a partir de la sacarosa (hasta un 20 % de los sólidos). Estos azúcares, en general, resultan perjudiciales (Ramos y col, 2006) (Ramos y col., 2007) para el proceso de fabricación de azúcar. No obstante, al estudiarse la influencia de los oligosacáridos de la caña sobre el hábito del cristal de sacarosa se observó que el componente aislado (con volumen de elusión correspondiente a la trehalosa) no alteraba prácticamente el hábito del cristal de sacarosa (Ramos y col., 2001).

Sin embargo, la posibilidad de que la caña forme trehalosa luego del corte en cantidades apreciables, como un mecanismo de respuesta al estrés durante la etapa de siembra y retoño, resulta atrayente tanto desde el punto de vista fisiológico como industrial. Ya que en el segundo caso incorporaría un constituyente interesante en las mezclas de oligosacáridos producidos a partir de la caña, dadas las propiedades beneficiosas que este azúcar agrega a los alimentos, Higashiyama T. (2002). La trehalosa al ingerirse se hidroliza a glucosa adsorbiéndose en el intestino delgado. Este azúcar protege y preserva las estructuras de las células en los alimentos y ayuda en el proceso de congelación y masticado de muchos productos alimenticios, ya que asiste en el mantenimiento de la textura deseada de los alimentos. Es también estable al calor y no participa en la reacción Maillard.

PARTE EXPERIMENTAL

Los experimentos se realizaron en general usando cañas frescas de 11 variedades que mostraban una alta tendencia a autodegradarse luego del corte, las que fueron detectadas entre 76 variedades estudiadas (Ramos y col, 2006), de ellas 9 mostraban la fracción cromatográfica donde podía aparecer la trehalosa). Véase la Tabla 1.
En esta primera parte del trabajo se presentan los estudios exploratorios usando la variedad Ja 60-5. Las cañas se cortaron manualmente en los campos aledaños al central Pablo Noriega, provincia Habana, las que se desfibraron y prensaron inmediatamente. Los jugos obtenidos se dejaron estar por 48h en presencia de un desinfectante apropiado y seguidamente se clarificaron por alcalización a pH 8.5, calentamiento por 2 minutos a ebullición y sedimentación. Los jugos clarificados se concentraron hasta un sirope de 50 ^oBx.

METODOS CROMATOGRAFICOS DE SEPARACION

A) COLUMNAS ABIERTA DE HIDROXIAPATITA ESFERICA (HYDROMAG).

La hidroxiapatita esférica usada fue de un tamaño de partícula de 50-60 micras. El material disperso en alcohol al 85 % se empleó en la preparación de una columna semi-preparativa 2.5 x 12 cm. (capacidad máxima de 30 mg de oligosacáridos)
Para determinar de la concentración de oligosacáridos en las muestras se empleó la columna siguiendo la metodología ya reportada (Ravelo y Ramos, 1995). La separación y cuantificación del oligosacáridos presentes en los jugos y siropes se realizó empleando dos gradientes alcohólicos lineales diferentes: (A1) de 90 a 40 % y (A2) de 90 a 70% en 500 cm³, usando una velocidad de flujo de 4 cm³/min. El segundo gradiente se empleó cuando la variedad de caña producía la 6-Kestosa. La columna permitió la separación del oligosacárido estudiado en repetidas corridas aplicando diluciones alcohólicas (en alcohol al 85 %) de los siropes, las que contenían alrededor de 20 mg de oligosacáridos. Las fracciones que correspondían a la trehalosa se unieron y concentraron hasta un sirope que se disolvió en metanol seco y se dejo cristalizar en una desecadora sobre cloruro de calcio, obteniéndose un producto cristalino. 
En todos los casos se empleó el método de antrona sulfúrico para la detección y estimación de la concentración de los oligosacáridos.
La hidrólisis del oligosacarido aislado se realizó en dos condiciones: 1) parcial: HCl 0.4 N, 65 ^oC, 30 minutos o enzimáticamente con invertasa a 30 ^oC y pH 5.2; (2) total: HCl 2N, 100 ^oC, 3 h. 
El poder reductor del oligosacarido se determinó usando soluciones de 1-2 mg en 1 cm³ de agua destilada de los diferentes oligosacáridos. A las soluciones se añadió 0.1 cm³ de las soluciones A y B de Felling, preparados según la metodología para la determinación de reductores según el método analítico de Eynon Lane. La mezcla se calentó en un baño hirviente por tres minutos. La aparición de un color rojo indica la presencia de un oligosacárido reductor. 

SEPARACIONES POR HPLC:

B) Cromatografía de Interacción Hidrofílica: Se usó una columna de Lichrosorb NH2, 10µ, 4*250 mm, empleando como eluyente mezclas de Acetonitrilo-agua al 85 % para la separación de los monosacáridos y de 80 % para la separación de mono, di y trisacáridos.

C) Fase inversa: Se usó una columna Ultropack TSK ODS 120 T, 10 µ, de dimensiones de 7*300 mm , se usó agua como eluyente.
En las separaciones por ambas columnas se empleó como detector un Refractómetro Diferencial KNAWER.

ESTUDIO POR RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR.

El espectros de RMN-13C fue determinado en un equipo Bruker ACF-250 a una frecuencia de 62.89 MHz en agua deuterada a 300 K y con acetona como referencia interna (31.55 ppm respecto a TMS)

DISCUSION

Al estudiar la naturaleza de los azúcares formados por la caña de azúcar luego del corte y la incidencia de los mismos en la producción de azúcar, se pudo determinar que los más perjudiciales resultaban ser la Lactosacarosa y un monosacárido conocido con D-Xilosa. Ambos azúcares producen grandes deformaciones en el hábito del cristal de sacarosa y un aumento sensible de pérdidas de azúcar por escapes de microcristales, alargados por su eje “c”, a través de las telas de las centrífugas. Adicionalmente se pudo determinar la presencia de otros dos oligosacáridos menos relacionados con los problemas industriales en nuestro país, conocidos como 1-Kestosa y la Rafinosa. No obstante, según las separaciones cromatográficas realizadas en la columna de  HYDROMAG  se pudo constatar que en los jugos de la caña frescas, los azúcares crudos y las mieles generalmente aparecen como mayoritarios 5 azúcares (AIS) de bajo peso molecular. Ver Figura. Aunque algunas variedades forman las otras dos Kestosas, ver Tabla 2.

Este quinto componente más frecuente, que no mostraba ejercer un efecto sensible sobre la morfología del cristal de sacarosa, cobra interés por: a) su aparición frecuente luego del corte de la caña y b) su probable vinculación con los mecanismos de respuesta al estrés de la caña luego del corte, durante la siembra y el retoño. El oligosacárido, aislado a partir de la primera variedad estudiada, la J60-5, coincide con la trehalosa según los tiempos de elusión obtenido por los  tres métodos usados. No pudiéndose hidrolizar el oligosacarido en condiciones suaves (no  aparece  poder reductor), ver Tabla 2, no resulta reductor y se obtiene solamente glucosa en condiciones drásticas de hidrólisis. Además, su espectro de RMN 13C coincide con el de  este  disacárido, ver Tabla 3. En el espectro 1H se observa la señal característica de la presencia de los protones anomérico α en 5.182 ppm con una J= 3.6 Mz.

CONCLUSIONES:   

El quinto componente aislado del jugo autodegradado (sin la acción de los microorganismos) de la variedad de caña Ja60-5 se ha identificado como el disacárido trehalosa: α-D-glucopiranosil α-D-glucopiranósido.

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