PARTE II : SU FORMACION EN DIFERENTES VARIEDADES DE CAÑA.

Ramos E. L., Ravelo S., ICINAZ, MINAZ                    

Palabras claves: trehalosa, caña, variedades, HYDROMAG, AIS, autodegradación.

Aquí puede ver la PARTE 1 !

En la primera parte de este trabajo se pudo demostrar que el oligosacarido: α-D-glucopiranosil α-D-glucopiranósido, conocido como trehalosa, es uno de los oligosacáridos que acumula luego del corte la variedad de caña J60-5 (Ramos y Ravelo, 2009). Para ello se emplearon varios métodos cromatográfico: 1) a baja presión, usando el adsorbente HYDROMAG para el aislamiento y identificación de los oligosacáridos presentes en el jugo, 2) por HPLC usando columna de Lichrosorb NH2, 10µ y de Ultropack TSK ODS 120 T, 10µ. Además, se empleó la espectroscopia protónica y de 13C para la confirmación de la estructura del oligosacárido aislado.

La trehalosa es el único azúcar capaz de proteger las biomoléculas del estrés ambiental. Está ampliamente distribuido en la naturaleza, siendo estable, inodoro y no-reductor. Este azúcar protege a algunos insectos y plantas de la desecación. La trehalosa ha demostrado ser un estabilizador de enzimas, proteínas, biomasas, preparaciones farmacéuticas y órganos para el transplante. La trehalosa se ha aprobado como un aditivo alimenticio en Europa y Estados Unidos(Schiraldi y col, 2002)

En este artículo se presentan los resultados obtenidos en la continuación de los estudios sobre la presencia de la trehalosa en la caña. En esta ocasión la investigación abarca el estudio de la acumulación de la trehalosa en 10 variedades seleccionadas entre un total de 76 que resultaron poseer una alta tendencia a formar los llamados Azúcares que Impurifican a la Sacarosa (AIS) en los jugos después del corte.

PARTE EXPERIMENTAL

  Los experimentos se realizaron usando cañas frescas de 10 variedades que mostraban una alta tendencia a autodegradarse luego del corte (Ramos y col., 2006). Entre ellas 8 mostraban contener uno o varios azúcares en sus jugos que eluía en la zona entre 86 y 92 cm3 al separar los AIS usando una columna de HYDROMAG y un gradiente alcohólico de 90 a 40 % en un volumen total de 500 cm3. En esta zona deben eluir la trehalosa y la 6-Kestosa. Véase la Tabla 1.

Las cañas se cortaron manualmente en los campos aledaños al central Pablo Noriega, provincia Habana, las que se desfibraron y prensaron inmediatamente. Los jugos obtenidos se dejaron estar por 48h en presencia de un desinfectante apropiado^[1]. Los jugos posteriormente se concentraron en un evaporador rotatorio a vació hasta un sirope de 50 ^oBx.

En  todos  los casos se empleó el método colorimétrico que usa la  mezcla antrona-sulfúrico para la detección y estimación de la concentración de los oligosacáridos.

El poder reductor del oligosacarido, se determinó usando soluciones de 1-2 mg en 1 cm³ de agua destilada de los diferentes oligosacáridos. A  las soluciones se añadió 0.1 cm³ de la solución A y B de Felling, preparados según la metodología para la determinación de reductores según el método analítico de Eynon Lane. La mezcla se calentó en  un  baño  hirviente  por  tres  minutos.  La aparición de un color  rojo  indica  la  presencia  de  un  oligosacárido reductor. 

METODOS CROMATOGRAFICOS DE SEPARACION:

1) SEPARACIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS USANDO COLUMNAS ABIERTA DE HIDROXIAPATITA ESFÉRICA (HYDROMAG).

La hidroxiapatita esférica usada fue de un tamaño de partícula de 50-60 micras. El material disperso en alcohol al 85 % se  empleó  en la preparación de una columna semi-preparativa 2.5 x 12 cm, con una capacidad  máxima de 30  mg  de oligosacáridos.

Para determinar de la concentración de oligosacáridos en las muestras se empleó la columna siguiendo la metodología ya reportada (Ravelo y Ramos, 1995). La  separación  y  cuantificación  del  oligosacáridos presentes en los jugos y siropes se realizó  empleando dos gradientes alcohólicos lineales diferentes: de 90 a 40 % y de 90 a 70% en un volumen total de 500 cm³, usando una velocidad de flujo de 4 cm³/min.

El segundo gradiente se empleó para aislar la trehalosa de los siropes. La columna permitió la separación del oligosacárido estudiado en repetidas corridas, aplicando una solución hidroalcohólica (en alcohol al 85 %) del sirope, la que contenían alrededor de 20 mg de oligosacáridos. Las fracciones que correspondían a la trehalosa (alrededor de los 160 cm³) se unieron y concentraron hasta un sirope que se disolvió en metanol seco y se dejo cristalizar  en  una  desecadora  sobre  cloruro  de calcio, obteniéndose un producto  cristalino. La 6-Kestosa con este gradiente eluye en los 368 cm³.

2) SEPARACIÓN DE MONOSACÁRIDOS USANDO COLUMNAS ABIERTAS DE HIDROXIAPATITA ESFÉRICA MODIFICADA. (HYDROMAG^M)

La hidrólisis del oligosacarido aislado se realizó  en  dos condiciones: 1) parcial:  HCl 0.4 N, 65 ^oC, 30 minutos y  (2) total: HCl 2N, 100 ^oC,  3 h. Los hidrolizados de 0.5 mg del oligosacárido en 2 cm³ de la solución ácida se evaporaron en un evaporador rotatorio, añadiéndose y evaporándose repetidas veces, porciones de agua destilada, para eliminar el ácido clorhídrico. El residuo se disolvió en 0.5 cm³ de agua destilada y se diluyó con otros 4.5 cm³ de alcohol absoluto, a la mezcla se añadió el preparado modificador de la hidroxiapatita, al que hemos llamado “HYMOD”. Se empleó una columna de HYDROMAG^M de 1.5 x 25 cm, previamente calibrada con soluciones patrones de diferentes monosacáridos, ver Figura 1. La separación de los azucares se realizó aplicando a la columna 2 cm³ de los hidrolizados (0.2 mg de la mezcla de monosacáridos) y luego se corrió con alcohol al 90 % conteniendo el agente modificador de la hidroxiapatita. La presencia de monosacárido en los eluatos se determinó usando el método colorimétrico basado en el  empleo de Trifenitetraazolio (TTZ), especialmente modificado con la adición de 10 % de CTAB al reactivo, para lograr una sensibilidad que permite la determinación colorimétrica entre 1 y 10 ppm de los monosacáridos en los eluatos (Ravelos y Ramos, 2005) .

3) FILTRACION POR GEL SEPHADEX G-15

La columna de Sephadex G-15 poseía unas dimensiones de 2 x 65 cm, usándose como eluente una solución de cloruro de sodio 0.02 M. Tenía un volumen de exclusión de 65 cm³, corriéndose con un flujo de 1 cm³ por minuto. Esta se calibró con patrones de diferentes pesos moleculares: Glucosa(115 cm³), Trehalosa(95 cm³) y Rafinosa(72 cm³).

La trehalosa aparece en muy bajas concentraciones en los jugos de la caña de azúcar, detectándose niveles de 10^-4 a 10^-3 mg/gramo de materia fresca (Bosch, 2005). No obstante, según nuestros estudios sobre la formación de oligosacáridos en la caña después del corte y durante la extracción industrial de los jugos (Ramos y col., 2006), se podría esperar el incremento de la concentración de este disacárido. La presencia de la trehalosa entre los oligosacáridos que forma la caña luego del corte aumenta el espectro de propiedades como edulcorante de la mezcla de estos azúcares, por lo que puede resultar aun más atractiva para la industria alimentaria. La trehalosa se reconoce como un estabilizador de enzimas, proteínas, biomasas, preparaciones farmacéuticas y órganos para el transplante (Schiraldi y col, 2002). Es en general un ingrediente beneficioso de los productos alimenticios, (Higashiyama, 2002), ya que mejora la calidad de las frutas deshidratadas y de ingredientes desecados que se usan ampliamente en la preparación de alimentos.

TABLA1: Absorbancia máxima obtenidas para cada componente al separar unos 20 mg de los AIS de cada variedad de caña con HYDROMAG, usando un gradiente lineal de un 90 a un 40 % de alcohol en un volumen total de 500 cm³.

TABLA2: Usando HYDROMAG y un gradiente alcohólico entre 90 y 70 % en un volumen total de 500 cm³. La Trehalosa eluye en un volumen de elusión de 160 cm³ y la 6-Kestosa en los 368 cm³.

En la actualidad la composición de estas mezclas de oligosacáridos no solo depende de las posibilidades que ofrece cada variedad, según su capacidad de formar los diferentes oligosacáridos, sino puede manipularse con la ayuda de los inhibidores IFOPOL(E). Estos productos actúan con especificidad para cada un de las transferasas de la caña (Ramos y Ravelo, 2008).

En la tabla 1 se puede observar la mezcla de azucares que puede formar las 11 variedades estudiadas. Como se aprecia de las 11 sólo en nueve se detecta la presencia de carbohidratos en las fracciones de 86-92 cm³ al separar los AIS usando el soporte cromatográfico HYDROMAG con un gradiente hidro-alcohólico de 90-40 % en 500 cm³. Zona donde pueden eluir la trehalosa y la 6-Kestosa.

Para discernir que oligosacáridos eluían en esta fracción, los residuos obtenidos de la evaporación a vació se diluyeron en alcohol al 90 % y se aplicaron a la columna de HYDROMAG, corriéndose la columna con un gradiente 90-70 % en 500 cm³. En estas condiciones la trehalosa eluye a los 168 cm³ y la 6 Kestosa a los 368 cm³. Para aislar el componente que cromatográficamente se correspondía a la trehalosa, se realizaron 5 corridas aplicando 20 mg le la mezcla de azúcares. Las fracciones correspondientes a la trehalosa se unieron, evaporaron a vació hasta obtener un residuo en forma de polvo que se mantuvo en desecadora sobre cloruro de calcio para luego cristalizar el azúcar desde sus soluciones en metanol. En la Tabla 2 se recogen los resultados obtenidos durante la caracterización de la trehalosa. Como se observa sólo en 6 de las variedades se observó la presencia de trehalosa en la mezcla de azúcares(AIS). Las tres restantes solo formaban a la 6- Kestosa en sus jugos.

[1] Con anterioridad se pudo comprobar que la formación de oligosacáridos en el jugo desinfectado reproducía a lo que ocurre en la caña, al dejar estar trozos de 20-25 cm en un ambiente estéril. 

CONCLUSIONES:   

La trehalosa puede aparecer como un componente más de la mezcla de oligosacáridos que forman algunas variedades de caña en sus jugos luego del corte.

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