Los ANCA en las vasculitis ANCA positivas

 

  Los ANCA en las vasculitis ANCA positivas. Generalidades y teorías de la acción patogénica de los ANCA


 

Los anticuerpos anti-citoplasma del neutrófilo o ANCA han sido descritos como autoanticuerpos presentes en diversas enfermedades autoinmunes. Estos anticuerpos han sido y son actualmente una herramienta básica en el estudio de un subgrupo de enfermedades autoinmunes de afectación vascular, las vasculitis de pequeño vaso ANCA-asociadas. En ellas se ha incluido la Granulomatosis de Wegener (GW), la poliangeítis microscópica (PAM) y el síndrome de Churg-Strauss (CH-ST). El papel preciso del ANCA en la patogenia de estas enfermedades todavía no ha sido totalmente resuelto.

ANCA y antígenos

Anticuerpo IgG

Los ANCA son autoanticuerpos dirigidos contra estructuras propias del cuerpo humano y presentes en el suero de determinados pacientes. En la actualidad, se han descrito como mínimo seis autoantígenos que servirían de diana. Todos ellos son proteínas que presentes en las células del organismo humano no generan respuestas inmunológicas, pero que en ciertas condiciones podrían llegar a ser reconocidas como estructuras extrañas contra las que desarrollar una respuesta. Se trata de enzimas azurófilos, algunos de ellos con una estructura homóloga y muy conservada. Se localizan en los gránulos azurófilos de los leucocitos polimorfonucleares, destacando los enzimas proteínasa-3 (PR3) y la mieloperoxidasa (MPO).

 

-La PR3, también llamada p29 o mieloblastina, es una molécula de un peso molecular aproximado de 29 kD. Posee una actividad enzimática hacia la elastina, la fibronectina y otras proteínas de la membrana basal como el colágeno de tipo IV y la laminina. También está descrita su capacidad para procesar la interleukina-8 (IL-8), una citokina con capacidad quimioatrayente de leucocitos polimorfonucleares, a una forma quimiotácticamente más potente, y de romper la proteína hsp28.

-La MPO es una proteína homodimérica con dos cadenas pesadas (58 kD) y dos ligeras (16kD) con actividad peroxidasa.

Diversos autores describieron estas proteínas como los antígenos diana de los ANCA en las dos principales vasculitis ANCA-asociadas que se conocen hasta ahora. Aquellas personas que sufren de GW poseen unos niveles elevados de ANCA anti-PR3. Por otro lado, los que sufren de PAM suelen presentar unos niveles séricos de ANCA anti-MPO anormalmente altos. Sin embargo, últimamente se ha venido descubriendo la existencia de ANCA con especificidad hacia otros antígenos presentes en el suero de enfermos con vasculitis. Estos antígenos son también enzimas azurófilos como la azurocidina, la catepsina G, la elastasa o la proteína inductora de la permeabilidad bacteriana (BPI). Su presencia en el suero de estos pacientes todavía no está muy estudiada.

 

P-ANCA

P-ANCA. Micrografía a 400 aumentos

 

Hasta ahora, la técnica más común de determinación de los ANCA es el análisis por inmunofluorescencia indirecta. En este método, una muestra sérica se pone en contacto con una preparación de leucocitos polimorfonucleares previamente fijados con etanol o formalina. Después de varios lavados y una incubación con un anticuerpo secundario fluoresceinado, se observa la preparación bajo un microscopio óptico de fluorescencia. Una persona experta puede llegar a reconocer dos tipos de patrones de fluorescencia diferentes, uno perinuclear (P-ANCA), otro citoplasmático (C-ANCA). El patrón P-ANCA corresponde con un alto porcentaje de fiabilidad al tipo de ANCA con especificidad PR3 (ANCA-PR3).

Sin embargo, el patrón P-ANCA es más difícilmente clasificable. Posiblemente coincidirá con el tipo ANCA anti-MPO, aunque no se pueden descartar los casos anti-BPI, anti-catepsina-G, anti-elastina, etc. que también presentan este patrón. En consecuencia, y para discriminar exactamente el tipo de ANCA con el que se puede tratar en el laboratorio hemos de recurrir a métodos de detección más precisos. El ensayo inmunoenzimático ELISA nos proporciona el grado de especificidad buscado.

 

Mediante este método, recubrimos una placa con el antígeno de elección, en este caso es la proteína MPO, añadimos la muestra de suero y tras varios lavados, incubación con un anticuerpo conjugado y una fase de revelado, podemos llegar a determinar con precisión la presencia o ausencia del anticuerpo ANCA-MPO en suero. De igual modo, podemos llegar a realizar un análisis semicuantitativo.

 

Sin embargo, incluso un análisis como éste puede llegar a generar discordancias y falta de correlación entre la presencia de ANCA-MPO y el antígeno de la placa. Diversas hipótesis se han propuesto para explicar este fenómeno:

 

C-ANCA

C-ANCA. Micrografía a 400 aumentos

 -El proceso de recubrimiento de MPO en la placa puede provocar cierta pérdida de los epítopos que reconoce el ANCA en la proteína. Éstos pueden quedar ocultos contra la superficie de la placa, impidiendo la interacción con el ANCA.

-Recientes estudios han confirmado la importancia de los epítopos conformacionales ante los meramente configuraciones en la interacción ANCA-MPO. En consecuencia, cualquier proceso que altera las características tridimensionales de la proteína puede afectar a la antigeneicidad de la proteína.

-La propia homología de la MPO con otras proteínas de los gránulos azurófilos puede provocar cierto grado de reconocimiento inespecífico por parte de los ANCA.

-El proceso de purificación de la MPO parte de los gránulos azurófilos de leucocitos humanos. Sin embargo, diversos autores han demostrado que estos “purificados” comerciales contienen impurezas de otras proteínas de estos gránulos. De ello, se deducen interacciones no deseadas como ANCA anti-BPI o ANCA anti-elastasa, por ejemplo.

En consecuencia, tests de ELISA con especificidad para cada una de las proteínas antigénicas de los ANCA son necesarios. En estos tests se determina la presencia sérica de ANCA contra PR3, MPO, catepsina G, elastasa, BPI o azurocidina.

La patogenia de los ANCA en las vasculitis ANCA asociadas

Aunque los ANCA son una herramienta básica en el diagnóstico de las vasculitis ANCA-asociadas, su papel preciso aún está por esclarecer. Hasta el momento, la investigación se ha dirigido al estudio del efecto del ANCA en la estimulación del leucocito polimorfonuclear. Aunque, su papel en la activación de otras poblaciones celulares como monocitos y células endoteliales es reconocido.

La acción del ANCA sobre los leucocitos polimorfonucleares

Cuando se produce un fenómeno inflamatorio, como puede ser el asociado a una infección, los leucocitos polimorfonucleares (PMN) estimulados por linfoquinas de los macrófagos (IL-1, IL-6, IL-8, TNF) o productos bacterianos (LPS) se transforman en PMN activados. Como resultado de esta activación se produce una liberación extracelular de enzimas lisosómicos entre los que destacan la PR3 y la MPO. Estos enzimas antes de liberarse sufren un proceso de translocación desde los gránulos lisosomales hasta la superficie de  la membrana celular. Si esto ocurre en presencia de ANCA se produce un proceso de amplificación de la activación leucocitaria comentada que se inicia con el reconocimiento del antígeno (PR3 o MPO) por parte del ANCA a través del fragmento Fab de este anticuerpo. Posteriormente el complejo antígeno-anticuerpo, que se forma en la superficie del neutrófilo, es internalizado y como consecuencia de ello se produce un gran proceso de estimulación por el cual se sintetizan y liberan gran cantidad de enzimas lisosómicos y de radicales libres oxígeno que tienen gran capacidad necrotizante y bactericida, y que iniciarán el daño endotelial.

Hipótesis de la necrosis vascular mediada por ANCA

La hipótesis de activación endotelial. ¿Acción del ANCA sobre el endotelio vascular?

La célula endotelial no es un elemento pasivo sino una célula muy activa dentro del contexto del fenómeno inflamatorio propio de las vasculitis ANCA-asociadas. Su actividad radica en la liberación de citokinas capaces de atraer células implicadas en la respuesta inmune como macrófagos (vía MCP-1) o leucocitos polimorfonucleares (vía IL-8). Asimismo es capaz de responder a la presencia de citokinas séricas en el medio expresando moléculas de adhesión en su superficie celular, favoreciendo la infiltración leucocitaria. Finalmente parece posible que la célula endotelial pueda post-activarse en respuesta a la acción de los ANCA. Existen datos preliminares que demuestran que el ANCA con especificidad PR3 es capaz de inducir la sobreexpresión de moléculas de adhesión (E-selectina, ICAM-1, VCAM-1) en el ámbito de la célula endotelial. La diana que reconocen estos ANCA en la superficie endotelial, así como el mecanismo por el cual induce la expresión de estas moléculas de adhesión, es hasta ahora desconocido. Algunos autores postulan que el ANCA anti-PR3 reconoce la presencia de PR3 en la superficie de la célula, que en situaciones de previa activación por citokinas pasaría del citoplasma a la superficie de la célula ya fuese a la membrana o la matriz extracelular. En cambio, otros autores han negado la existencia de PR3 en la célula endotelial invalidando esta vía de reconocimiento. Estos autores postulan que la presencia de niveles séricos elevados de PR3 pueden llegar a favorecer la adhesión pasiva del antígeno circulante a la superficie del endotelio, llevando a la aparición de una diana no-propia del endotelio. Independientemente del mecanismo de interacción entre ANCA y célula endotelial parece claro que los ANCA anti-PR3 reconocen la célula endotelial in vitro. En definitiva, la implicación del endotelio en la patogenia de las vasculitis podría ser estar relacionada con:

Hipótesis de la infiltración leucocitaria mediada por ANCA

Estos estudios se han realizado mayoritariamente en suero de pacientes con GW y ANCA con especificidad PR3. Se desconoce si los ANCA con especificidad MPO u otros ANCA con especificidad contra otros antígenos del gránulo azurófilo del leucocito polimorfonuclear soportan esta capacidad de reconocimiento de antígenos de la superficie del endotelio y dónde se localizan estos antígenos (en la membrana o en la matriz extracelular). También se desconoce si los ANCA de pacientes inactivos o sin vasculitis mantienen esta capacidad de interacción con el endotelio.

En resumen parece que el ANCA puede actuar amplificando la estimulación leucocitaria producida por un desencadenante no caracterizado. Algunas observaciones permiten sugerir que estos mismos anticuerpos serían capaces de activar la célula endotelial para la expresión de moléculas de adhesión ligandos de otras que expresaría el leucocito polimorfonuclear. Esto contribuiría a sustentar el papel de este anticuerpo no sólo como marcador sino también como factor patogenético y contribuiría a tener una base de conocimiento para la búsqueda de estrategias de tratamiento más precisas que las actualmente utilizadas basadas en la manipulación de interacciones ANCA-endotelio o en la sustracción de los ANCA del suero mediante plasmaféresis o inmunoadsorción.


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