วิธีการทดลอง

วิธีการทดลอง

ตอนที่ 1 การสกัดสารจากราด้วยเทคนิคการสกัดสารด้วยตัวทำละลาย

อุปกรณ์

1.ขวดรูปกรวยขนาด 250 cm³

2.กรวยแยกพร้อมขาตั้ง

3.กระดาษกรอง

4. เครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุน ( rotary evaporator )

5. เครื่องดูดอากาศ ( high vacuum pump)

6.ขวดบรรจุสารขนาดเล็ก ( vial )

สารเคมี

1.เอทิลอะซีเตต ( CH₃COOCH₂CH₃)

2.ตัวอย่างเชื้อรา Aschersonia samoensis I 4593

วิธีการทดลอง

1.นำตัวอย่างราที่อยู่ในขวดรูปกรวยมากรองจะพบว่าส่วนที่เป็นตัวเซลล์นั้นติดอยู่บนกระดาษกรอง ส่วนของอาหารเลี้ยงเชื้อ( supernatant ) จะผ่านกระดาษกรองลงไปในขวดรูปกรวย

2.รินส่วนของอาหารเลี้ยงเชื้อลงในกรวยแยก เติมเอทิลอะซีเตต เขย่ากรวยแยก ( ในขณะที่เขย่าต้องคลาย ก็อก(stop cock)ที่กรวยแยกบ้างเพื่อลดความดัน )

3.วางกรวยแยกที่ขาตั้งจะพบว่า สารในกรวยแยกแยกเป็นสองส่วน ชั้นล่างคือน้ำและชั้นบนคือเอทิลอะซีเตต ไขก็อกนำชั้นน้ำออก ทำการสกัดซ้ำอีก 2 ครั้ง

4.นำส่วนของอาหารเลี้ยงเชื้อในเอทิลอะซีเตตไประเหยเอทิลอะซีเตตออกด้วยเครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุนบรรจุสารที่ได้ลงในขวดบรรจุสารขนาดเล็กแล้วนำไปทำให้แห้งด้วยเครื่องดูดอากาศ

5.ชั่งน้ำหนักสาร

6.นำสารที่ได้ไปทำให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทกราฟีต่อไป

ตอนที่ 2 การทำสารให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทกราฟี

อุปกรณ์

1.เครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุน ( rotary evaporator )

2.ขวดรูปกรวยขนาด 50, 250,1,000 cm³

3.กรวยขนาดเล็ก

4.กระดาษกรอง

5.คอลัมน์แก้ว

6.หลอดทดลองขนาดใหญ่

7.หลอดหยดขนาดยาว ( Dropper )

8.เครื่องดูดอากาศ ( high vacuum pump)

9.ขวดบรรจุสารขนาดเล็ก ( vial )

สารเคมี

1.ส่วนอาหารเลี้ยงเชื้อของรา Aschersonia samoensis I 4593 จากขั้นตอนที่ 1

2.เมทานอล ( CH₃OH)

3.เมทิลีนคลอไรด์ ( CH₂Cl₂ )

4.เอทิลอะซีเตต ( CH₃COOCH₂CH₃)

5.Sephadex LH-20

วิธีการทดลอง

1.ละลายสารสกัดของอาหารเลี้ยงเชื้อของรา(1495.8 g)ด้วยเมทานอล กรองด้วยกระดาษกรอง นำส่วนที่ละลายมาระเหยตัวทำละลายออกให้สารละลายมีความเข้มข้นมากขึ้น

2.ล้างคอลัมน์ด้วยเมทานอล

3.เปิดคอลัมน์ให้ระดับของเมทานอลเท่ากับผิวหน้าของ Sephadex

4.ละลายสารในข้อ 1 ด้วยเมทานอลเล็กน้อย บรรจุสารลงคอลัมน์โดยใช้หลอดหยดขนาดยาว

5.ชะสารรอบๆคอลัมน์อีก 3 ครั้ง เติมเมทานอลให้สูงเกือบถึงปากคอลัมน์

6.เปิดคอลัมน์รองรับสารด้วยหลอดทดลองขนาดใหญ่ เมื่อรองรับสารจนเกือบเต็มหลอด ให้เปลี่ยนหลอดรองรับสาร โดยกำกับหมายเลขหลอดทดลองตามลำดับ

7.รองรับสารจนแน่ใจว่าสารออกหมดแล้ว

8.นำสารที่ได้ในหลอดทดลองแต่ละหลอดไประเหยตัวทำละลายออก

รูปที่ 4 แสดงการรองรับสารด้วยหลอดทดลองขนาดใหญ่

9.บรรจุสารที่ได้ในขวดบรรจุสารขนาดเล็ก ชั่งน้ำหนักสารและนำไปทำให้แห้งด้วยเครื่องดูดอากาศ

10.นำสารที่ได้จากข้อ 9 ไปตรวจสอบโครงสร้างด้วยเทคนิคทางสเปกโทรสโกปีต่อไป

หมายเหตุ การชั่งน้ำหนักสารต้องชั่งภาชนะที่บรรจุสารก่อน และเมื่อนำไปบรรจุสารจึงกลับนำมาชั่งอีกครั้ง

รูปที่ 5 แสดงการระเหยตัวทำละลายด้วยเครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุน( rotary evaporator )

ตอนที่ 3 การหาสูตรโครงสร้างทางเคมีของสารที่สกัดได้
ขั้นตอนการเตรียมสารก่อนทำการตรวจสอบโครงสร้างทางเคมีของสาร

อุปกรณ์

1.ช้อนตักสาร (spectula)

2.ขวดบรรจุสารขนาดเล็ก(vial)

3.หลอดหยด(dropper)

4.หลอด NMRพร้อมฝาปิด

สารเคมี

1.สารที่ได้จากการแยกในการทดลองตอนที่ 2

2.deuterated DMSO

วิธีการทดลอง

1.นำช้อนตักสารตักสารในvialที่ได้จากการทดลองตอนที่ 2 (ให้สารมีน้ำหนักประมาณ 10 mg) ลงในvial

2.ละลายสารด้วย deuterated DMSOให้สารละลายมีปริมาตรประมาณ 4-5 cm³

3.ใช้หลอดหยดดูดสารละลายจากข้อ 2 ลงในหลอดNMRพร้อมปิดฝา

4.นำสารที่ได้ไปตรวจสอบโครงสร้างของสารด้วยเทคนิคทางสเปกโทรสโกปีในที่นี้ใช้เทคนิคนิวเคลียร์แมกเนติกส์เรโซแนนซ์สเปกโทรสโกปี (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; NMR) ซึ่งได้รับความอนุเคราะห์จากดร.ประสาท กิตตะคุปต์ นักวิจัยศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ

รูปที่ 6 แสดงหลอด NMR และสารที่เตรียมไว้

รูปที่ 7 แสดงเครื่อง NMR

ตอนที่ 4 การทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพของสาร

นำสารสกัดที่ได้และทราบโครงสร้างไปทดสอบความเป็นพิษต่อ เซลล์ตัวอ่อนของผีเสื้อ, เซลล์ตัวอ่อนของยุง, เซลล์ของหนู,เซลล์ไตของหนูและเซลล์ตับของคน ณ ห้องปฏิบัติการทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพ ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติซึ่งได้รับความอนุเคราะห์จากดร. Patricia Watts