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AChE의 활성자리는 alcohol 부분에 관계된 특성을 결정하는 anionic site와 실제 촉매 과정에 관여하는 esteratic site로 이루어져 있다. Anionic site는 이름이 암시하는 것처럼 ACh의 부분적으로 양성인 4차 암모늄 머리쪽을 선호하는 전기적으로 음성인 자리이다. ACh의 대부분의 결합은 anionic site의 쿨롱 및 소수성 상호작용의 합이 가장 크며 이는 단순히 기질을 결합하고 배향하는데 제한되지 않고 스스로 큰 촉매효과를 가진다.
그림 1. The active site and catalytic mechanism of acetylcholinesterase consists of two subsites. Esteratic site에 존재하는 serin 잔기의 수산기는 친핵체로서, histidine의 imidazole은 serin 잔기의 친핵성도를 증진시키는 general base로서 작용하고, proton은 choline을 choline dipolar ion보다는 이탈기로 만들기 위해 전달되는 촉매로서 역할을하여 ACh를 choline과 acetyl enzyme으로 가수분해시킨다(그림1). Esteratic site의 acetyl enzyme 유도체가 촉매과정에 포함되므로 이 자리 주위 구조가 기질의 산기능에 관계된 특성을 결정한다. AChE의 mechanistic scheme은 식 1과 같다.
S: 기질 일반적으로 P1과 P2의 농도가 반응속도에 영향을 미칠 정도로 충분치 않고 복합체의 해리가 빠르므로 식 2로 단순화되며,
이 반응의 반응속도는 식 3과 같은 Michaelis 형을 가지게 된다.
여기서, ACh에 대해서 kcat = 7×105min-1이고 25℃, pH=7.0, 0.1M NaCl 조건에서 KM값은 9×10-5M을 가진다. 낮은 기질농도에서 E0 → E이고, 속도결정단계는 효소의 acetylation이며 속도는
효소의 acetylation에 대한 2차속도상수, kcat/KM는 2×105으로 매우 높은 값을 가진다. 또한 먀요 연구소의 유안-핑 팡 등에 의해 컴퓨터 모델연구에서 활성부위외에도 입구부분에 또다른 결합부위를 가질 것임이 제안되었으나 THA를 포함한 AChE의 X선 결정구조에서는 이러한 제안된 THA의 결합을 확인할 수 없었다. 그리하여 THA 두분자를 연결하여 각각 활성부위와 입구부분에 동시에 결합할 수 있도록 하였다. 두 작용 리간드 사이에는 7개의 메틸렌기로 연결되었는데, 결과적으로 THA 자체보다 1,000배나 더 효능이 크게 나타났다. 연결사슬이 더 길어지면, 효능이 약간 약해지기는 하지만 여전히 강한 억제능력을 유지하였고, 추가적인 실험에서 입구부분의 결합부위도 THA에 대해 선택적인 결합을 이룬다는 것이 밝혀졌다. |
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AChE assay에 대한 요구는 양수에 존재하는 AChE isoenzyme의 연구가 신경관 결함의 진단에 유용하다는 것이 받아들여지면서 급격히 증가하게 되었다. AChE의 효소활성을 측정하는데는 electrometric, titricmetric, manometric, colorimetric, radiometric, potentiometric mothodes 등의 다양한 기술들이 사용된다. 독성생물학적 연구에 대해 자주 사용되는 assay는 장치가 간단하며 정교하고 빠른 electrometric 기술과 colorimetric 기술이다. Electrometric method는 표준완충용액에서 효소가수분해반응에 의해 생성된 acetic acid의 양을 한정된 시간 간격에 대한 pH변화 term으로 측정하는 방법이다. Colorimetric method는 Acetylthiocholine(ATCh)이 AChE에 의해 식 4처럼 acetic acid와 thiocholine으로 가수분해 되며,
생성된 thiocholine과 DTNB(5,5'-dithio- bis-2-nitrobenzoic acid)가 식 5와 같이 반응하여 생성된 노란 음이온, 5-thio-2-nitrobenzoate의 증가에 의해 410nm에서 촉매활성이 측정된다.
AChE활성은 pH 7.5∼9.0에서 최대이며 높은 pH에서는 효소없이 기질, ACh이 상당 량 가수분해되어 높은 blank를 이끈다. pH 8에서는 100mmol/l phosphate buffer를 사용하는 것이 관례적이다. 몇몇 연구에서는 blank를 무시할 수 있는 부분으로 제거하기 위해 낮은 pH가 적절하다고 알려져 있다. Radiometric methode는 AChE에 대해 예민하고 정확하며 신경섬유의 1μ이하의 양을 측정하는데 유용하고 가수분해 되지 않은 방사성탄소로 표지된 기질 [1-14C] acetylcholine이 높은 농도의 ketone안에서 sodium tetraphenylboron으로 추출하거나 reineckate로 침전시킴으로써 제거시킨 후 효소가수분해 결과로 형성된 수용액상에 존재하는 표지된 [1-14C]acetate를 측정하는 방법이다. |
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AChE 억제제는 anionic site 억제제, esteratic site 억제제와 fluoride 억제제등이 있다. Anionic site 억제제는 3차나 4차 암모늄이온과 같은 치환된 암모늄이온으로 anionic site에 기질 대신 결합되어 AChE 활성을 억제하므로 전위 억제제(potential inhibitor)라 불리기도 한다. Phenyltrimethylammonium과 N-methylpyridinium, N-methylquindinium, isoquinolinium, N-methylacridinium ion들은 특히 좋은 억제제이다. Belleau와 Tani가 N,N-dimethyl-2-chloro-2-phenethylamine에 의한 적혈구의 비가역적 억제가 보고되자 새로운 개념의 억제제가 소개되었다. 이 억제제의 활성형태는 식 6처럼 효소를 alkylation하거나 anionic site에 가깝게하는 aziridinium (ethyleniminium) ion이다.
Esteratic site억제제에는 organophosphates, methane sulfonates와 carbamates가 있으며 비가역 억제제나 acid trasferring 억제제로 불리운다. 이들의 억제 반응은 그림 2에 나타낸 것처럼 AChE(serine잔기의 히드록시기)가 친핵체로서 작용하여 효소-억제제 복합체를 형성한 후 효소-기질 복합체와는 달리(식 2) 매우 느리게 가수분해 된다.
그림 2. The various kinds of esteratic site inhibitors. a) Organophosphates, b) Methane sulfonates, c) Carbamates
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Since 99 . 8 . 30 |
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Acetylcholinesterase(acetylcholine
hydrlase, AChE, EC 3.1.1.7)는
신경세포와 신경근접합부를 지나는 신경세포간 접합부위 회로 후막 등의
신경전달신경계에서 중요한 효소로 신경전달물질인 acetylcholine(ACh)을
acetate와 choline으로 가수분해시킨다.(그림1) 신경근접합부 전막에
신경자극이 도착하면 신경접합부 틈에서 ACh방출을 유도하며, ACh는
신경근접합부 후막에서 확산되어져 특정한 수용체들에 의해 결합되어진
후, 이 효소에 의해서 가수분해되고 신경근접합부 후막의 편극화에
의해서 재저장된다. 신경섬유에서의 ACh의 효소가수분해는 신경기능의
neurohumoral transmitter로서 공급된 후 이 물질을 빠르게 제거하는
방법으로 Dale에 의해서 제안되었다. 후에 cholinesterase 활성이 혈액상에서
밝혀졌고, 최소 두 개의 독특한 효소가 적세포 형태안에 acetylcholinesterase와
혈청 형태안에 butyrylcholinesterase가 있음이 보여졌다. 이 두 효소의
반응속도론적 특성은 다른 조직안의 효소를 분리하는데 기초가 된다.
(식
1)
(식
2)
(식
3)
이다.
이므로
(식
4) 
(식
5)
(식
6)