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효소반응에 관한 최초의 일반적인 속도식은 1902년에 Brown이 효소-기질 복합체 형성에 대한 이론을 응용하여 1903년에 Henri에 의하여 식 1과 같이 유도되었다. Henri는 효소(E), 기질(S), 효소-기질 복합체(ES)간에 화학평형이 존재하여 ES, E, S간의 결합 및 해리속도가 ES가 효소와 생생물(P)로 변환되는 속도보다 훨씬 빠르다고 가정하였다. 기질의 농도가 효소의 농도보다 훨씬 커서 ES 복합체의 형성이 기질의 농도에 영향을 거의 미치지 않는 정류상태조건 하에서 초기반응속도를 식 1에 대하여 유도하면 Henri식, 식 2가 얻어진다.
여기서 Ks는 k-1/k1과 동일하며 ES의 해리상수이다. K는 k2E0/Ks에 해당하며 E0(가해준 효소의 총농도)에 비례한다. S0는 기질의 초기농도이다. 이 식은 반응속도가 가해준 효소의 양에 비례하며 기질의 농도를 증가시킬 때에는 상한치에 접근하는 속도론적 포화현상(그림1(a))을 나타내는 실험적인 결과가 설명되었고 1913년 Michaelis와 Menten에 의해 정당성이 확인되었다. Michaelis-Menten식(식 3)은 기질농도와 효소반응속도 사이의 관계에서 보듯이 반응속도를 최대속도 Vmax에 최대한 접근시켜도 Vmax를 얻기 위해서 필요한 기질농도의 불확정으로 인한 곤란을 대부분의 효소에 있어서 공통된 동일한 형을 갖는다는 것으로부터 어떤 효소가 그의 최대속도(Vmax)의 1/2속도는 나타내는 경우에 있어서, 그의 특이적기질의 농도인 Michaelis-Menten 상수, KM을 얻어 효소촉매 반응에 있어서 기질농도와 반응속도 사이의 관계를 정확히 나타내었다.
여기서 KM은 (k-1+k2)/k2이다. Michaelis-Menten식을 식 4처럼 이중역수(double- reciprocal)를 취하면 Lineweaver-Burk식, 식 5를 얻을 수 있으며 1/υ0을 1/[S0]에 대해서 도시하면 그림 1(c)처럼 기울기가 KM/Vmax, 1/υ0 축상의 절편이 1/Vmax이고 1/[S0] 축상의 절편이 -1/KM인 직선이 얻어지므로 정확한 KM과 Vmax를 구할 수 있으며 효소의 억제 메카니즘을 해석하는데 매우 편리하다. 또한 Henes는 식 3을 식 6로 변환하여 그림 1(d)와 같이 [S0]/υ0와 [S0]의 직선관계를 유도하였고 Woolf와 Eadie, Hofstee는 식 7으로 변환시켜 그림 1(e)와 같이 υ0를 υ0/S0에 대하여 도시하여 그 직선의 절편과 기울기에서 KM과 Vmax를 계산하였다.
그림 1. The calculation method for Vmax and KM. |
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효소는 기질 이외의 물질과도 복합체를 형성할 수 있다. 그 결과 기질과의 복합체 형성의 정도를 변화시키기도 하고 생성물의 형성 속도에 영향을 끼치기도 한다. 효소와 비공유 복합체를 형성함으로써 효소와 기질의 반응속도를 감소시키는 화합물을 억제제라고 부른다. 억제제가 효소 혹은 효소-기질 복합체와 결합하는 방법, 억제제가 결합함으로써 기질의 반응속도가 영향을 받는 양식에 따라 억제작용의 유형을 여럿으로 구분한다. 경쟁적(competitive) 억제작용, 무경쟁적(noncompetitive) 억제작용, 비경쟁적(uncompetitive) 억제작용이 가장 특징적인 유형으로 꼽는다. 경쟁적 억제제는 식 8처럼 효소 자체와만 복합체를 형성하고 ES복합체와는 결합하지 않으며, 경쟁적 억제제와 결합한 효소는 기질과 복합체를 형성하지 않는다. S0》E0, I0》E0인 조건 하에서 식 8의
반응양식에 대하여 정류상태 속도식을 유도하면 E0 = [E]+[ES]+[EI]의 질량균형식을 사용하고, [EI] 및 [I]와 [E]간에 존재하는 관계식 식 9와 식 10을 적용하면 속도식, 식 11 및 Michaelis-Menten식에 대한 일반속도식인 식 12이 유도된다. 효소반응에서 A가 작아지거나 B가 커지면 속도가 감소하며 이 경우 A는 영향을 받지 않고 B가 증가하여 속도가 감소하게 되므로 KM이 외형적으로 증가함을 의미한다. 만약 가해준 화합물이 아무런 억제작용을 나타내지 않으면 식 12의 A는 k2이고 B는 KM이어야 한다.
여기서 억제제가 존재할 경우 A가 감소하는 대신 B는 변함이 없으며 k2가 감소한다. 비경쟁적 억제작용은 식 14와 같이 억제제가 효소 자체와 복합체를 형성하지 않고 효소-기질 복합체와만 결합하여 ESI를 형성하고, ESI복합체에서는 생성물이 생성되지 않는 억제작용이다. S0》E0, I0》E0인 조건 하에 정류상태 속도식을 유도하면 식 12이 얻어지며
그러나 이 상반된 두 요인은 B》[S]일때에는 상쇄되어 결과적으로 반응속도에 억제제가 아무런 영향을 미치지 못하게 되지만 그 밖의 조건에서는 A의 감소가 우선적으로 작용하여 전체적으로 억제작용을 일으키게 된다. 위의 세가지 유형의 억제작용은 가장 특징적인 것으로 실제 효소반응에서는 이러한 특징적인 억제작용의 혼합형 혹은 변형이 개입된 부분경쟁적(partial competitive) 억제작용, 부분무경쟁적(partial noncompetitive) 억제작용, 혼합형 억제작용등이 있으며 Table 1에 요약하였다. Table 1. Velocity equation varioubles for the typical inhibitions.
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효소반응속도의 측정시 시간에 따른 반응물 혹은 생성물의 농도변화를 합리적으로 추적할 수 있는 물리적인 방법의 선택중 가장 간편하게 측정하는 방법은 분광학적인 방법이다. 즉 농도에 비례하거나 혹은 수식에 의하여 농도에 비례하는 양으로 쉽게 환산할 수 있는 분광학적인 성질을 반응시간별로 측정하는 것으로 전자적 흡수스펙트럼의 흡광도가 농도에 비례한다는 Beer-Lambert 법칙에 의하여 흡광도의 변화를 반응물 혹은 생성물의 농도변화로 간주할 수 있는 UV-Visible spectrophotometer가 가장 흔히 사용된다. 시간에 따른 기질 혹은 생성물의 농도변화를 측정한 뒤에는 υ0를 계산하여 속도변수(kcat, KM, kcat/KM)를 계산하여야 한다. 억제작용이 개입될 경우 정확한 억제방식을 구명하고 해당 평형상수를 실험자료로부터 분석하는 것이 요구되며 이는 식 12의 A와 B가 [I]에 의존하는 관계를 분석하면 억제작용의 방식 및 Ki, α, β 등의 수치 등을 얻을 수 있다. 직선식에 의한 도법 중에서 가장 흔히 사용되는 Lineweaver-Burk 도법을 식 12에 적용하면 식 15이 얻어진다. 원래의 Lineweaver-Burk 도법에서는 1/υ0를 1/S0에 대하여 도시하여 직선관계를 구하는 것이나 E0를 고정시켜야 하는 제한조건이 뒤따르므로 식 16으로 전환시켜 E0/υ0를 1/S0에 대하여 도시한다. 그림 2에 전형적인 억제작용에 대한 변형된 Lineweaver-Burk 도법을 나타내었다. 억제작용의 도표분석의 또다른 방식으로는 Dixon 방법이 있으며 [I]에 대하여 1/υ0를 도시함으로써 얻어지는 직선의 기울기는 KM/VmaxKiS0, 절편은 (1 + KM/S0)/Vmax이고 Vmax를 상수로 취급하려면 E0를 고정시켜야 하므로 1/υ0대신 E0/υ0를 사용한다.
그림 2에 포함된 각 도표의 직선을 구하기 위해서는 [I]를 고정하고 여러 S0에서 υ0를 측정하여야 한다. 각 직선이 교차하는 점의 좌표를 파악하고, 각 직선이 두 축과 교차하는 좌표 및 각 직선의 기울기가 [I]에 의존하는 양상을 검토하여야 하는 것이다. 이와 같은 방법으로 억제작용의 방식 및 Ki, KM, k2, α, β등 여러 가지 변수의 값도 평가할 수 있다. 실험적으로 취급할 때 신뢰성 높은 결과를 얻으려면 직선을 적어도 5개는 얻어야 하며, 각 직선마다 적어도 5개의 속도자료를 얻어야 한다. 또한 식 12을 적분하여 최소자승법에 의거하여 처리하고 그 결과로부터 억제작용의 방식과 각종 변수치를 계산하는 방법도 있으며 위 두 방법보다 훨씬 적은 수의 속도자료로부터 정보를 얻을 수 있는 이점이 있다.
그림 2. Lineweaver-Burk plots for the typical inhibition.
(횡축: 1/S0,
종축: E0/ν0) |
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Since 99 . 8 . 30 |
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효소반응속도론은 효소의 농도, 기질·생성물·억제제·활성화제
등 결합물질의 농도, pH, 이온세기, 온도 등이 미치는 영향을 분석함으로써
반응메카니즘에 관한 정보를 얻을 수 있다. 속도상수를 결정하면 이
값으로부터 세포 내의 기질과 생성물의 농도로부터 반응속도를 계산할
수 있고 생리조건 하에서의 반응의 방향을 예측할 수 있다. 아울러 생체
내에서 효소의 활성도가 제어되는 방식을 이해할 수 있다.
(식
1)
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2)
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3)
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4)
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5)
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6)
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7)
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10)
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(식 15)
(식 16)