ELISA para la detección de ANCA anti-MPO
ANCA Vasculitis Moléculas de adhesión Técnicas de laboratorio Detección de ANCA Otras Publicaciones Sobre ANCA Del autor Recomendados El autor Créditos		Objetivo Realizar una medida semicuantitativa de la presencia de ANCA anti-MPO en suero

 Sensibilización de placas de mieloperoxidasa

Material

Placas Microtiter ELISA. Immuno Module Poly Sorp F16. Nunc

Micropipetas

Reactivos

Mieloperoxidasa Calbiochem, La Jolla, CA, USA. Cod. 475911

Acetato sódico (CH3COONa)

Cloruro sódico (NaCl)

Carbonato magnésico (MgCO3)

Carbonato sódico (NaCO3)

Bicarbonato sódico (NaHCO3)

Azida sódica (NaN3)

Tween20

Método

Preparación de reactivos

Buffer MPO (acetato)

0.05 M CH3COONa

0.1   M NaCl

Buffer de sensibilización (coating buffer)

0.05 M Carbonato

Buffer PBS-BSA 1%

Buffer de lavado (PBS-Tween20 al 0.05%)

Técnica

Sensibilización

1. Diluimos un vial de mieloperoxidasa liofilizada con un peso de 100 ug de MPO en 200 ul de buffer MPO.
2. Diluimos 200ul de esta dilución en 60 ml de buffer de sensibilización (coating buffer) 1:300
3. Alicuotamos 100 ul  de esta solución en cada pocillo de la placa. Se sensibiliza media placa.
4. Incubamos a 4^oC durante toda la noche.

Bloqueo

1. Descartamos el volumen de los pocillos tirándolo con fuerza sobre la pica.
2. Incubamos cada pocillo con 200 ul de PBS-BSA, 1 hora a 37^oC
3. Lavamos 3 veces con PBS-Tw20 y secamos bien la placa.
4. Conservamos las placas a –80^oC envueltas en papel de plata.

ELISA MPO

Material

Placas Microtiter ELISA. Nunc-Inmuno Module Poly Sorp F16 sensibilizadas.

Lector de placas de ELISA.

Reactivos

Método

 Preparación de reactivos

PBS-Tw20-BSA

PBS

1% BSA

0.05% Tw20

PBS-BSA

PBS

1% BSA

Buffer substrato

1 M dietanolamina

0.05 mM MgCl2

0.05 M carbonato de magnesio

IgG conjugada

10 ml PBS-Tw20-BSA + 10 ul de IgG conjugada fosfatasa alcalina (PA)

Substrato

2 pastillas de PARANITROFENOL (PNP) + 10 ml de buffer substrato

Técnica

1. Descongelamos la placa sin desenvolver para evitar la condensación de agua en los pocillos.
2. Descongelamos el PBS-Tw20-BSA
3. Descongelamos los sueros estándar, control y problema.
4. Diluimos las muestras:

5.   Montamos la placa:

6. Incubamos 1 hora a temperatura ambiente.
7. Lavamos 3 veces con 200 ul de PBS-Tw20.
8. Preparamos la dilución 1:1000 de IgG conjugada con fosfatasa alcalina.
9. Añadimos 100 ul de la dilución de IgG conjugada.
10. Incubamos 1 hora a temperatura ambiente.
11. Lavamos tres veces con PBS-Tw20
12. Preparamos el sustrato de la reacción: 2 pastillas de p-nitrofenol en 10 ml de buffer substrato.
13. Añadimos 100 ul de este sustrato de fosfatasa alcalina diluido.
14. Incubamos 1 hora a temperatura ambiente.
15. Leemos a los 60 minutos . La DO₄₀₅ final ha de ser superior a 1.000 en el caso de los estándars más concentrados.

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