Técnicas empleadas en la detección de los ANCA
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Resumen histórico de las técnicas empleadas en la detección de ANCA

Los métodos para la detección de ANCA han sido diversos desde que estos autoanticuerpos fueron descritos por primera vez en el año 1964. Estos métodos incluyen la inmunofluorescencia indirecta (IFI), el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo inmunoenzimático (ELISA), el Western blot, el dot blot y la inmunoprecipitación. 

La IFI fue la primera técnica empleada en la detección de ANCA. Originariamente su utilización se restringía a la detección de anticuerpos antinucleares (GS-ANA), pero muy pronto se estandarizó la técnica para la observación de los patrones ANCA. Para su realización se aislan los leucocitos polimorfonucleares de sangre heparinizada mediante la técnica de gradiente Hypaque, seguida de un bloqueo de las células con albúmina humana. Las células se han de fijar en etanol a 4^oC, aunque hay laboratorios que han empleado la formalina como fijador de polimorfonucleares. Si utilizamos etanol como método de fijación el resultado de la técnica nos presenta dos tipos de patrones de fluorescencia, el C-ANCA y el P-ANCA, que discrimina dos tipos de ANCA con especificidad por diferentes antígenos de los gránulos azurófilos de estas células. Durante la fijación en etanol, se rompe la membrana de los gránulos y las proteínas básicas (cargadas positivamente) son redistribuidas hacia el núcleo cargado negativamente. Sin embargo, la fijación en formalina evita la migración de las proteínas y no es posible distinguir ninguna diferencia entre un patón C-ANCA y otro P-ANCA.

Estos problemas en la interpretación de los patrones llevaron al desarrollo de los ensayos en fase sólida. El primero de estos ensayos descritos empleaba un extracto ácido de neutrófilos con una buena sensibilidad (96%), pero no muy alta especificidad (80%). Este sistema presentaba componentes nucleares que producían reacciones cruzadas con otros autoanticuerpos de tipo ANA, además de los ANCA.

En consecuencia, el desarrollo de un inmunoensayo que utilizaba extractos de gránulos de leucocitos polimorfonucleares (los que contenían los antígenos de los ANCA) fue un gran adelanto en la mejora de la detección de los ANCA. Sin embargo, este ELISA detectaba ANCA tanto con especificidad para la PR3 como para otros antígenos presentes en estos gránulos como la MPO, la elastasa, etc.

Lüdemann avanzó un paso más cuando construyó una columna de cromatografía de afinidad con anticuerpos ANCA de pacientes con GW para la separación de PR3 de leucocitos polimorfonucleares degranulados. A partir de este preparado de PR3 purificada pudo diseñar un nuevo ELISA más específico y más sensible y que detectaba exclusivamente ANCA con especificidad PR3.

De igual modo, posteriormente, cuando se determinó que el antígeno del P-ANCA es sobre todo la MPO se ha utilizado este antígeno en la sensibilización de placas de ELISA y la detección de ANCA con especificidad MPO.

En la actualidad, los enzimoinmunoensayos se han convertido en técnicas muy útiles en la detección de ANCA. Su rapidez en ciertos casos, como el del ELISA screening, llega a ser de media hora.

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