ELISA para la detección de ANCA anti-PR3

 

Objetivo

Realizar una medida semicuantitativa de la presencia de ANCA anti-PR3 en suero

 Material   

Wielisa-kit Anti-PR3 antibodies, cod. PR3102:

Pocillos sensibilizados con Ag  PR3

 

Control negativo

Solución de lavado

Control positivo

p-nitrofenil fosfato (PNP) en tabletas

IgG conjugada AP

Búfer sustrato

Diluyente: PBS

Estándares

 

Métodos

Preparación de los reactivos

Solución sustrato

5 ml de buffer substrato + 1 tableta p-nitrofenol (PNP)

Conservación máxima: 6 horas

 

Técnica

  1. Atemperamos previamente el kit comercial.
  2. Centrifugamos la muestra de sangre 5 minutos, 2000 rpm
  3. Recogemos el suero.
  4. Diluimos el suero 1/100 (1000 ul  de diluente PBS + 10 ul de suero).
  5. Pipeteamos 100 ul de cada una de las soluciones en cada pocillo según el siguiente diagrama:

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

100 ul SD1

100 ul uer1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

B

100 ul SD2

100 ul suer1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

C

100 ul SD3

100

suer2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

D

100 ul SD4

100

suer2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

E

100 ul SD5

100

suer3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

F

PBS

100

suer3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G

 

100 +

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

H

100 -

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. Incubamos 60 minutos.
  2. Descartamos el volumen.
  3. Lavamos con 200 ul de solución de lavado (PBS-Tw20) 3 veces.
  4. Añadimos 100 ul del conjugado a cada pocillo y esperamos 60 minutos.
  5. Descartamos el volumen.
  6. Lavamos con la solución de lavado (PBS-Tw20) cuatro veces.
  7. Añadimos 100 ul de la solución substrato
  8. Incubamos 60 minutos.
  9. Leemos a DO405  con el programa MPO.PR3.MRIN cada 15 minutos hasta 1 hora. Consideramos positivos aquellos resultados superiores a 20 UE/ml

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