Inmunofluorescencia indirecta sobre células endoteliales para la detección de moléculas de adhesión
ANCA Vasculitis Moléculas de adhesión Técnicas de laboratorio Detección de ANCA Otras Publicaciones Sobre ANCA Del autor Recomendados El autor Créditos		Objetivo Detectar la presencia o ausencia de las moléculas de adhesión VCAM-1, ICAM-1 y E-selectina en la superficie de células endoteliales humanas mediante inmunofluorescencia indirecta.

 Material

Placas de cultivo.

Cubreobjetos.

Pinzas de punta fina.

Agujas.

Reactivos

Anticuerpo primario y secundario (marcado con FITC).

Paraformaldehido.

Formol.

Acetona

Etanol.

Cloruro de sodio (NaCl).

Fosfato bibásico de sodio (Na₂HPO₄).

Fosfato monobásico de potasio (KH₂PO₄).

Glicina.

Métodos

Preparación de los reactivos

Anticuerpo primario

• 1/100: anti-Eselectina (2 ml + 198 ml PBS)
• 1/100: anti-VCAM1 (2 ml + 198 ml PBS)
• 1/50: anti-FvW (4 ml + 196 ml PBS)

Anticuerpo secundario

• 1/50: anti-VCAM1 (2 ml + 98 ml PBS). Como norma general, el anticuerpo secundario será doblemente concentrado que el anticuerpo primario.

Paraformaldehido 4%

EtOH:Acetona 1:1

PBS

7.650 g NaCl

0.724 g Na₂HPO₄

0.210 g KH₂PO₄

Enrasamos a 1l con agua destilada

Glicina 0.1% en PBS

                40 mg glicina y enrasar a 40 ml agua destilada

Medio de montaje para inmunofluorescencia (conservamos a –20^oC preservado de la luz).

0.01  m PO43-, pH-7.4

0.15 m NaCl

100 mg p-fenilendiamina + 10 ml de PBS + 90 ml glicerina.

Ajustamos el pH-8  con 0.5 M de carbonato-bicarbonato tamponado a pH-9

Procedimiento

1. Fijar.
2. Lavar.
3. Marcar.
4. Lavar.
5. Montar.

Previamente, lavamos los cubres. Retiramos el volumen de MEM suplementado, añdimos Hank’s y pasamos a...

1. Fijar

   Añadimos un volumen suficiente de fijador en los pocillos de la placa. El fijador puede ser

   • Paraformaldehido 4%: es un fijador de membrana y componentes citoplasmáticos (mínimo de 15 minutos).
   • Formol 1-2%
   • EtOH:Acetona (1:1): es preferido para fijar mitocondrias. En general, destruye lípidos y antígenos de membrana, pero deja intacto el esqueleto celular (5 min).

Depositamos los cubres con células en este volumen y lo dejamos toda la noche.

2. Lavar

Retiramos el volumen de fijador y, con la ayuda de una pipeta Pasteur, hacemos tres lavados en PBS frío. Es importante eliminar la mayor parte de fijador pues formol son fluorescentes.

3. Incubamos con Glicina al 0.1% (o a concentración superior) que evita la unión inespecífica del anticuerpo (10 minutos)

4. Lavar con PBS.

5. Marcar

Depositamos una gota de 60 ul/cubre del anticuerpo (marcaje directo o indirecto) diluido en PBS

Damos la vuelta al cubre y lo dejamos suavemente sobre este volumen. De este modo, células y anticuerpo se tocarán.

Lo dejamos incubar 30-90 minutos (óptimo 45-60) en oscuridad si el marcaje es directo. Si es indirecto no es necesaria la oscuridad

6. Lavar con PBS.

7. Anticuerpo secundario (si la inmunofluorescencia es indirecta. Si no, pasar al punto 8)

En una placa nueva añadimos una gota de 60 ul en un pocillo

Depositamos el cubre encima de la gota

Incubamos unos 40 minutos, protegido de la luz, a temperatura ambiente

8. Lavar con PBS
9. Retiramos el volumen y realizamos más lavados. 3x5 minutos con PBS en oscuridad para eliminar el exceso de anticuerpos

10. Montar.

Añadimos una sola gota del medio de montaje para inmunofluorescencia sobre el portaobjetos (<de 20 ml)

Dejamos caer el cubre muy suavemente sobre el portaobjetos, de modo que la cara que contiene las células toque la gota.

Cementamos el cubre al porta con laca de uñas.

Observación al microscopio óptico de fluorescencia a 40 y 100 (oil) aumentos.