Inmunodetección de moléculas de adhesión en cultivos de células endoteliales
ANCA Vasculitis Moléculas de adhesión Técnicas de laboratorio Detección de ANCA Otras Publicaciones Sobre ANCA Del autor Recomendados El autor Créditos		Objetivo Detectar la presencia de las moléculas de adhesión VCAM-1, ICAM-1 y E-selectina sobre la superficie de células endoteliales humanas.

 Materiales

PBS-BSA 1%

1 g de BSA enrasado a 100 ml de PBS

Anticuerpos

Primarios (1:5000 de anti-VCAM-1 y anti-ICAM-1, 1:2000 de anti-CD62E)

Secundarios (1:5000’)

Control positivo: TNFa 5 ng/ml

Control negativo: anticuerpo secundario (1:5000’)

Blanco: cultivos con T199

Solución de revelado

1 pastilla de PNP en 5 ml de búfer substrato de dietanolamina

Método

Activación del endotelio

1. Después de haber dejado crecer las células en placas durante un mínimo de dos días retiramos el volumen de medio de crecimiento T199 y lavamos una vez con Hank’s. El volumen lo retiramos con multicanal, pero se añade Hank’s pocillo a pocillo.
2. Añadimos 100 ml de medio de crecimiento con condiciones problema:
3. Dejamos incubar en cámara de CO₂ (5%) a 37^oC durante:
   • Si vamos a detectar E-selectina: 4 horas.
   • Si vamos a detectar VCAM-1: 4 horas.
   • Si vamos a detectar ICAM-1: 24 horas.

Fijación

1.  Descartamos el medio de cultivo y secamos la placa
2. Lavamos con PBS atemperado a 37^oC
3. Incubamos con 100 ul de formaldehido al 4% en PBS (atemperado a 37^oC) a 4^oC durante toda la noche. Esto si queremos detectar VCAM-1 o ICAM-1. Sin embargo, para la detección de E-selectina nunca utilizaremos p-formaldehido, sino Etanol frío 5 minutos (seguidamente bloqueamos con PBS-BSA 1% toda la noche a 4^oC).
4. Descartamos el volumen

Ensayo inmunoenzimático

1. Lavamos 3 veces con PBS (200 ul/pocillo).
2. Incubamos con 100 ml de PBS-BSA 1%, 1h, temperatura ambiente, en agitación.
3. Incubación con 100 ul del anticuerpo primario, 1h, temperatura ambiente, en agitación.
   • Para detección de VCAM-1: 1/5000
   • Para detección de E-selectina: 1/2000
   • Para detección de ICAM-1: 1/5000

4. Descartamos el volumen y lavamos con 200 ul de PBSx3
5. Incubamos con 100 ul del anticuerpo secundario (1:5000’), en agitación, 1hora, temperatura ambiente.
6. Lavamos con 200 ul de PBSx3

Revelado

1. Incubamos con 100 ul de la solución de revelado, en rotación, a temperatura ambiente una hora.
2. Leemos la DO₄₀₅

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