Purificación de IgG por cromatografía de afinidad
ANCA Vasculitis Moléculas de adhesión Técnicas de laboratorio Detección de ANCA Otras Publicaciones Sobre ANCA Del autor Recomendados El autor Créditos		Objetivo Purificar fracciones de IgG a partir de volúmenes de suero diluido

Material

Columna de intercambio iónico HiTrap affinity columns (HiTrap Protein G 1 ml. Pharmacia Biotech).

Jeringas

Tubos de vidrio.

Filtro Millex-HA. Non-pyrogenic sterile 0.45m. Millipore.

Tiras de pH.

Pasteurs de vidrio.

Espectrofotómetro.

Eppendorfs.

Reactivos

• Start Buffer: 20 mM Na-Fosfato, pH 7.0

  1.24 g PO₄NaH₂.2H₂O

  Enrasar a  499,68 ml  con A.D.

  Llevarlo a un pH 7.0

• Buffer de elución: 0.1 M glicina-HCl, pH 2.7

  0.751 g glicina-HC

  Enrasar a 100 ml con A.D.

  Llevarlo a un pH 2.7

• Buffer Tris: 1 M Tris-HCl, pH 9.0

  12.11 g Tris-HCl

  Enrasar a 100 ml con A.D.

  Llevarlo a un pH 9.0

Métodos

1. Colocamos el adaptador para la jeringa en la columna.
2. Lavamos la columna de su contenido de etanol con 2 ml de start buffer o de agua destilada.
3. Equilibramos la columna con otros 2 ml de start buffer
4. Preparamos cada uno de los tubos (fracción) de vidrio (o eppendorfs) con 60 ul de Tris-HCl.
5. Preparamos el suero:
   • En un tubo de vidrio diluimos 1 ml de suero en 3 ml de start buffer (dilución ¼).
   • Filtramos con un filtro de 0.45 um de diámetro de poro.
   • Medimos el pH con una tira. Debe estar cerca de la neutralidad.

6. Pipeteamos (con Pasteur de vidrio) este volumen a una jeringa (por la columna se debe pasar siempre un mínimo de 1 ml). Conectamos esta jeringa a la columna y pasamos la muestra. Este primer volumen extraído se rechazará.
7. Pasamos 5 ml del start buffer. Despreciamos también este volumen.
8. Con una jeringa de 5 ml eluimos la columna con 4 ml de buffer de elución (glicina). Recogemos fracciones de 1 ml en los tubos de vidrio preparados. Si hemos hecho bien el proceso encontraremos que al agitar los 1.06 ml de cada tubo se forma un poco de espuma.
9. Leemos a DO₂₈₀ (D.O.=0.25-0.5). Si alguna de las fracciones nos da DO>1 haremos una dilución 1/10 (50 ul de fracción y 450 ul de PBS con un blancoc de PBS). En cálculos x10
10. Recuperaremos la fracción con mayor concentración de IgG (seguramente la 2ª) y la guardaremos a  -20ºC en un eppendorf. Para recuperar las IgG de eppendorfs congelados, centrifugaremos los eppendorfs en micrófuga y alicuotaremos el sobrenadante. Volveremos a leer la DO₂₈₀
11. Recomponemos la columna con 3 ml de buffer de elución, pasamos 5 ml de start buffer y la mantenemos en EtOH al 20%