Recuento y viabilidad de células endoteliales
ANCA Vasculitis Moléculas de adhesión Técnicas de laboratorio Detección de ANCA Otras Publicaciones Sobre ANCA Del autor Recomendados El autor Créditos		Objetivo Hacer un recuento de células viables en cámara de Neubauer mediante el colorante azul tripán.

 Material

Cultivo de células endoteliales creciendo en confluencia en un frasco.

Cámara de Neubauer.

Reactivos

Tripsina-EDTA en MEM suplementado.

Colorante azul tripán.

PBS

Hank’s

Método

Preparación de reactivos

Solución de tripsina

20 ml de solución de tripsina 10x+ 180 ml de MEM suplementado (y filtramos).

Azul tripán 4 %

2 ml de azul tripán+50 ml de PBS

Filtramos antes de utilizar.

Técnica

1. Succionamos y descartamos el sobrenadante.
2. Lavamos con 5 ml de Hank’s
3. Añadimos 2 ml de solución de tripsina atemperada a 37^oC durante 1 ó 2 minutos.
4. Sacamos el frasco de la estufa, le damos un golpe seco y observamos que todas las células se hayan desprendido.
5. Añadimos 4 ml de MEM suplementado y desaglomeramos las células
6. Añadimos 6 ml de MEM suplementado y aún otros 12 ml de MEM suplementado.
7. Recogemos 100 ul de suspensión celular a 900 ul de solución azul tripán al 4% en PBS.
8. Incubamos 5 minutos.
9. Realizamos un recuento celular con la cámara de Neubauer (40x, sobre las cuatro cuadrículas periféricas).

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