CONTROL BIOLÓGICO IN VIVO DE DOTHIORELLA SP., CAUSANTE DE LA PUDRICIÓN APICAL DE LA GUAYABA, POR TRICHODERMA HARZIANUM .

J. A. Hernández Y M. A. Arcia.

RESUMEN

La pudrición apical del fruto de la guayaba (PAF) puede causar hasta un 100 % de perdida durante la época de mayor incidencia. Actualmente no se ha establecido un control eficiente, económico y no contaminante. Se ha observado control in vitro de Dothiorella por Trichoderma harzianum, pero no se tiene evidencia de su efectividad sobre la fruta. El objetivo de este trabajo fue comprobar en el ámbito del laboratorio la eficacia de Tricobiol^®, en fruta cosechada de guayaba. Las evaluaciones se llevaron a cabo en la Unidad Técnica Fitosanitaria de La Universidad del Zulia. Se evaluaron tres tiempos, 24 h antes, 0 h y 24 h después de la inoculación del patógeno; y dos formas de aplicación de Trichoderma sobre la fruta, inmersión en suspensión de 3x10⁶ conidios/ml y micelio en discos de PDA de 5 mm de diámetro. El patógeno se colocó en discos de PDA de 5 mm de diámetro, como testigo se utilizó un tratamiento de control químico con Carbendazim en dosis comercial. Las variables medidas fueron porcentaje de infección y severidad de la enfermedad. El diseño estadístico fue totalmente al azar con cinco repeticiones. Se corroboró in vivo el control de Dothiorella por Trichoderma, al compararlo con el control químico no hubo diferencias significativas. Bajo esta perspectiva, hace falta evaluar el producto Tricobiol^® en plantaciones de guayabo, para poder validar su uso en el control de PAF y poder así entregarle al productor una herramienta de manejo no contaminante.

Palabras clave adicionales: Psidium guajava, Botryosfaeria dothidea, Tricobiol^®, Carbendazim

Biological control in vivo, of Dothiorella sp., causal agent of apical soft rot of guava fruits by Trichoderma harzianum

The apical soft of the guava (AS) could cause until the 100% of the losses in the time of great incidence. Now it have not settled down a plan of efficient control, economical and not pollutant of this fruit, control has been observed in vitro of Dothiorella sp. by Trichoderma harzianum, however evidence of their success on the fruit is not had. The objective of this work was check the efficacy of Tricobiol^® in the environment of the laboratory, commercial product formulated starting from this fungi biocontrolador, in fruit harvested of guava. The evaluations were carried out in the Laboratory of the Unit Technical Fitosanitaria of The University of the Zulia . it was evaluated time and form of application of Trichoderma on the fruit with concerning the pathogens; witness was utilized the control chemical with one of the fungicide that has offered control, the Carbendazim to the commercial dose, the measured variables like treatment they were percentage of infection and severity. The statistical Design was totally at random with five repetitions. In vivo was corroborated the biocontrol of Dothiorella by Trichoderma, upon comparing it with the control chemical there were not significant differences. Under this perspective, already one could evaluate the use of Trichoderma in plantations of guajabo, using the Tricobiol^®, like commercial product, in order to could validate their use in the biocontrol of AS and could deliver it so to the producer a tool of control not pollutant.

 Aditional key words: Biological control, Psidium guajava L. Tricobiol^®, Carbendazim

 INTRODUCCIÓN

El guayabo (Psidium guajava L.), es uno de los frutales más importantes cultivados en el municipio Mara del estado Zulia, con una superficie sembrada de 4.000 hectáreas aproximadamente y un rendimiento de 30.000 kg/ha/año. Su fruto es apreciado no sólo para consumo fresco, por su alto contenido de vitamina C, sino también en la industria, para la elaboración de pulpa, concentrados, jugos, jaleas y compotas, tanto para el mercado nacional como internacional.

Desde 1984, cuando el cultivo del guayabo comenzó a establecerse comercialmente en el estado Zulia, la pudrición apical del guayabo (PAF), causada por Dothiorella fase asexual de Botryosphaeria dothidea Moug, comenzó a causar daños, acentuándose con el tiempo los problemas ocasionados por esta enfermedad.

Son varias las alternativas que se han planteado para solucionar este problema, entre las cuales se encuentra el control biológico mediante el uso de Tricobiolâ , fungicida biológico formulado a base de Trichoderma harzianum (Hordi).

El uso de Trichoderma como biocontrolador de la PAF, constituyen una herramienta nueva en la producción de guayaba (4,5), por lo que es necesario evaluar y profundizar en los aspectos de validación del producto, manejo, dosis, frecuencia de aplicación, para lograr tener así la solución a este problema que tantas perdidas a causado. Sin embargo, antes de cubrir de cubrir estos aspectos en el campo, se debe evaluar en el laboratorio el control de Dothiorella por Trichoderma sobre la fruta, para poder así lograr tener mayor información de la forma de control de este biocontrolador sobre el patógeno.

Hongos del genero Trichoderma están entre los más promisorios agentes de biocontrol, por sus propiedades antagónicas en contra de los hongos patogénicos de plantas (3, 11), ya que además de controlar una gran cantidad de hongos en las raíces de las plantas, tiene la facultad de controlar enfermedades foliares en un amplio rango de cultivos (9). Ya que a pesar de ser un habitante natural del suelo, tiene la capacidad de sobrevivir en el filoplano (8) y en el antoplano (8, 12).

El biocontrol es técnicamente factible para un rango de enfermedades del follaje y frutos en varios sistemas de cultivo (12). En el control de Monilinia fructicola causante de la pudrición marrón de frutos, Trichoderma logró controlar mejor la enfermedad que la levadura biocontroladora Rhodoturula sp. También ha controlado eficientemente la pudrición en los frutos de fresa ocacionada por Botrytis cinerea (8). El éxito del biocontrol se ha incrementado marcadamente en los últimos años para patógenos que infectan flores, enfermedades del césped y patógenos en restos de cultivos (13).

Lo et al. (10), compararon las poblaciones de Trichoderma del suelo y las del follaje; y observaron que en la última semana de evaluación las poblaciones del suelo disminuyeron de 6 a 5 unidades formadoras de colonia (UFC)/g suelo, mientras que las poblaciones del follaje se mantuvieron en 6 UFC/50 g de follaje, lo cual indica que en el ambiente aéreo Trichoderma tiene mayor capacidad de ocupar el nicho que el follaje le ofrece. Sin embargo, Andrew (1), señala que el éxito del biocontrol en la filosfera es más desafiante que en la rizosfera, y depende de los factores que afectan la capacidad de colonización y dominancia competitiva en la comunidad foliar.

Los objetivos del presente trabajo fueron evaluar en la fruta de guayaba la efectividad del control biológico de Trichoderma tomado del producto comercial Tricobiol^®, determinando dos aspectos. La forma y el tiempo de aplicación del biocontrolador con respecto al patógeno. Luego de determinar la forma y el tiempo, comparar el control biológico de la PAF con el control químico ofrecido por Carbendazim.

MATERIALES Y MÉTODOS

Determinación de momento y forma de aplicación de Trichoderma

Recolección de frutos sanos: Se recolectaron frutos sanos con madurez fisiológica (100 % la piel verde), en la plantación comercial de guayaba de la agropecuaria Los Ciénegos ubicada en el municipio Mara del estado Zulia. Los frutos fueron trasladados al Laboratorio de Diagnóstico de Enfermedades de Plantas, de la Unidad Técnica Fitosanitaria de la Facultad de Agronomía de La Universidad del Zulia, en cajas tapadas de anime.

Los frutos fueron desinfectados por 3 min con una solución de hipoclorito de sodio al 10 % y lavados con agua destilada. A pesar de lucir sanos, en algunos frutos se presentó posteriormente la infección en su parte apical. Para diferenciar esta infección natural de la realizada en el laboratorio, se inoculó Dothiorella sp. en un área fuera de la parte apical del fruto, a través de heridas realizadas con una aguja de disección estéril. El patógeno fue tomado en discos de PDA (papa dextrosa agar) de 5 mm de diam de colonias de 5 d de edad; y se colocó de tal manera que el micelio del hongo estuviera en contacto con el fruto.

El biocontrolador Trichoderma harzianum, se tomó de aislamientos realizados del polvo del producto comercial Tricobiol^®.

Se realizaron tres evaluaciones, una para determinar la forma de aplicación, otra para determinar el momento de aplicación, y la última evaluación para comparar el control biológico y el químico.

Forma aplicación: Sobre las heridas se colocó Trichoderma harzianum de dos formas diferentes. 1. En un disco de PDA de 5 mm diam proveniente de cápsulas de petri con colonias de 5 d de edad; al igual que el patógeno el disco de micelio se colocó de tal manera que el biocontrolador hiciera contacto directo con las heridas realizadas en el fruto, se colocó una gota de agua esterilizada para mantenerlo húmedo. 2. En la inmersión por 10 seg del fruto en una suspensión de 3x10⁶ conidios/ml de Trichoderma.

Momento de aplicación: Se evaluaron tres momentos de aplicación del Trichoderma, Momento 1: 24 h antes de la inoculación del patógeno. Momento 2: 0 h antes de la inoculación del patógeno y Momento 3: 24 h después de la inoculación del patógeno.

Los frutos inoculados se colocaron sobre vasos plásticos bajo las condiciones ambientales del laboratorio, 22 °C y luz continúa, el área de trabajo se cubrió con una malla de tul, a fin de permitir aireación e impedir entrada de insectos.

El diseño experimental fue un totalmente al azar con cinco repeticiones por momento y forma de aplicación, para ambas evaluaciones el testigo fue cinco frutos inoculados con Dothiorella sin recibir ninguna aplicación de Trichoderma, a demás de este testigo, hubo frutos controles los cuales no recibieron ninguna inoculación y permitieron observar la infección proveniente del campo, ya que a pesar de que lucían sanos, se enfermaron posteriormente en la parte apical del fruto.

Efectividad del Trichoderma en el biocontrol de la PAF (Dothiorella sp.) en compararción con el control químico de Carbendazim

Luego de conocer el mejor momento y forma de aplicación del Trichoderma para el control de Dothiorella en el fruto, se procedió a comparar este biocontrol con el control químico del fungicida Carbendazim.

Se siguió la misma rutina para la recolección y desinfección de los frutos; así como para la inoculación del patógeno. La aplicación del funguicida químico y biológico se realizó sumergiendo completamente los frutos en una suspensión de los productos por 30 seg. Las dosis utilizadas fueron de 1 ppm para el Carbendazim, y de 3x10⁶ conidios/ml tomados de una colonia de Trichoderma de 5 d de edad, aisalada a del producto comercial Tricobiol. El momento de la aplicación de los tratamientos fue 24 h antes que el patógeno.

El Diseño experimental fue un totalmente al azar con cinco repeticiones por tratamiento, los cuales tuvieron conformados por el control químico, el control biológico y el testigo, el cual fue sólo inoculado con el patógeno y no recibió ningún control. La unidad experimental constó de un fruto. El análisis de varianza de los datos se calculó con el uso del paquete estadístico Statistix versión 1.0 para Windows.

Las variables evaluadas fueron severidad de la enfermedad y porcentaje de infección, para la primera se midió el avance de la lesión por un periodo de 5 a 7 días, a intervalos de 24 h, expresando la variable en cm² acumulados. Para el porcentaje de infección se relacionó la fruta enferma con el total de fruta inoculada

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Momento de aplicación de Trichoderma

El tiempo de inoculación del patógeno en la fruta cosechada afecto la respuesta del biocontrol. El mejor tiempo de inoculación para obtener un buen control fue colocar al Trichoderma (proveniente del producto comercial Tricobiol^®), 24 horas antes que el patógeno, registrándose diferencias significativas con los demás tiempos de aplicación (fig. 1). Estos resultados mantienen la misma tendencia a lo observado por Isea et al. (7), quienes utilizando tratamientos químicos y naturales en frutos de guayaba poscosecha, determinaron que las menores incidencias de Dothiorella sp. se registraron cuando los tratamientos se aplicaron 24 h antes que el patógeno. Igualmente, se ha señalado que Trichoderma spp. controla mejor a Monilinia fructicola, causante de la pudrición marrón de frutos de hueso, cuando es aplicado 12 h antes que el patógeno.

Probablemente, la aplicación del biocontrolador antes que la inoculación del patógeno, crea condiciones adversas que impiden el establecimiento de la enfermedad.

Formas de aplicación de Trichoderma

No hubo diferencias significativas entre las dos formas de aplicación de Trichoderma. En ambas formas de aplicación el biocontrolador logro disminuir significativamente (p: 0,05), la severidad y el porcentaje de infección en relación con el control o fruta no tratada. Los valores promedios de severidad para la fruta tratada fueron de 1,3 cm² en relación con 4,2 cm² en la fruta inoculada con el patógeno y no tratada con el biocontrolador (Fig. 2A); y para el porcentaje de infección fue del 40 % contra 100 % para la fruta tratada y la fruta no tratada con Trichoderma, respectivamente (Fig. 2B).

Comparación del biocontrol y el control químico

No se registraron diferencias significativas (p: 0,05) en la severidad de la PAF entre los controles químico y biológico (Fig. 3), corroborándose lo observado a nivel in vitro (5), en donde el desarrollo del patógeno es afectado tanto por el Carbendazin como por el Trichoderma. .

La expresión de la sintomatología en aquellos frutos tratados con Trichoderma difirió de los frutos controles, en éstos la pudrición se desarrollo a mayor velocidad, hasta cubrir completamente el fruto, así mismo presentó el color marrón oscuro y el aspecto humedo característico de la PAF; mientras que en los frutos tratados con Trichoderma la expresión de la sintomatología varío desde frutos sin síntomas, hasta frutos con el desarrollo de una pequeña lesión de aspecto seco y color marrón claro (Fig. 4).

El momento de inoculación del patógeno a la fruta cosechada afectó la respuesta del control biológico. El mejor momento de aplicación del Trichoderma fue 24 h antes que la inoculación del patógeno, para obtener un buen control; lo que sugiere desde el punto de vista práctico que esta enfermedad se debe controlar preventivamente y no cuando los síntomas ya estén presentes.

No se detectaron diferencias en la forma de aplicación del Trichoderma, sin embargo, la forma más práctica de aplicarlo fue sumergir los frutos en la suspensión de conidios del biocontrolador.

Estadísticamente no se detectó diferencias significativas entre la efectividad del control realizado por Trichoderma y Carbendazim

(A) Severidad de la infección de la PAF (Dothiorella sp).

(B) Porcentaje de infección de la PAF (Dothiorella sp.)

LITERATURA CITADA

1. Andrews, J. 1992. Biological control in the phyllosphere. Annu. Rev. Phytopathol. 30:603-635
2. Benhamou, N. and Chet, I. 1993. Hyphal interactions between Trichoderma harzianum and Rhizoctonia solani: Ultraestructure and gold cytochemistry of the mycoparasitic process. Phytopathology 83:1062-1071.
3. Danielson, R. and Davey, C. 1973. The abundance of Trichoderma propagules and the distribution of species in forest soils. Soil Biology and Biochemistry 5:485-494.
4. Hernández, J., Isea, F., Arcia, A., y Santos, R. 1998. Primer Reporte del Control Biológico in vitro de Dothiorella dothidea. Resúmenes XLIV Reunión Anual de la Sociedad Interamericana de Horticultura Tropical, Barquisimeto, Venezuela. p. 51.
5. Hernández, J., Arcia, A., y Ramírez, R. 1999. "Comparación in vitro del control químico y biológico de Dothiorella sp., causante de la pudrición apical de la guayaba (Psidium guajava L). Revista de la Facultad de Agronomía - LUZ 16(suplemento 1):49-55.
6. Hong, C.; Michailides, T., and Holtz, B. 1998. Effects of wounding, inoculum density, and biological control agents on postharvest brown rot of stone fruits. Plant Disease 82:1210-1216.
7. Isea, F., Mora, A., Santos, R. y Castro, C. 1995. Control poscosecha de la pudrición apical de los frutos del guayabo (Psidium guajava). Revista Forestal Venezolana 1:66
8. Kovach, J. and Finkelstein, J. "Using honey bees disseminate Trichoderma harzianum to strawberries for Botrytis control". <http://www.nysaes.cornell.edu/ ipmnet/ny/fruits/papers/sberry_rpt.html>. Abril 1998.
9. Lo, C., Nelson, E. and Harman, G. 1997. Improved biocontrol efficacy of Trichoderma harzianum 1295-22 for foliar phases of turf diseases by use of spray applications. Plant Disease 81:1132-1138.
10. Lo, C., Nelson, E., Hayes, C. and Harman, G. 1998. Ecological studies of transformed Trichoderma harzianum straim 1295-22 in the rhizosphere and on the phylloplane of creeping bentgrass. Phythopathology 88:129-136
11. Lorito, M., Harman, G., Hayes, C., Broadway, R., Tronsmo, A., Woo, S. and Di Pietro, A. 1993. Chitinolytic enzymes produced by Trichoderma harzianum: Antifungal activity of purified Endochitinase and Chitobiosdase. Phytopathology 83:302-307.
12. Nelson, M. and Powelson, M. 1988. Biological control of grey mold of snap beans by Trichoderma hamatum. Plant Disease 72:727-729.
13. Suton, J. and Peng, G. 1993. Manipulation and vectoring of biocontrol organisms to manage foliage and fruit disease in cropping systems. Annu. Rev. Phytopathol. 31:473-493