หน้าแรก | บทคัดย่อ | ที่มาและความสำคัญ | วิธีดำเนินการทดลอง | ผลการทดลอง

อภิปรายผลการทดลอง | สรุปผลการทดลอง | ปัญหาและข้อเสนอแนะ | เอกสารอ้างอิง

ชั่ง Peptone 1.0 g ,Yeast extract 0.6 g ,Ammonium nitrate 3.0 g ละลายในน้ำกลั่น 800 ml ปรับ pH 6.8 โดยใช้ phosphoric acid และปรับปริมาตรของอาหารเลี้ยงเชื้อเป็น 1000 ml เติม Agar 15 g นำไปเข้าไมโครเวฟเพื่อให้ agar ละลาย ก่อน นำไปautoclave ที่ อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที เติม Chloramphenicol (50 mg/ml) 1 ml เติม Olive oil emulsion ที่อุ่น ๆ ปริมาตร 30 ml ผสมให้เข้ากัน เทอาหารเลี้ยงเชื้อที่เตรียมได้ ลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อชั้นล่างจากข้อ 3 ประมาณ 5 ml รอให้วุ้นแข็ง

แสดงผล olive และ olive oil emulsion ที่เตรียมได้

ละลาย tween-80 1 กรัมลงในน้ำกลั่น 500 ml ที่อุ่น ๆ อุณหภูมิประมาณ 45-50 องศา เซลเซียส เพื่อให้ tween 80 ละลายดีขึ้น เติม Olive oil 100 ml นำสารผสมที่ได้ไปปั่นด้วยเครื่อง blender เป็นเวลา 1 นาที จากนั้นจะได้ olive oil emulsion ที่มีลักษณะขาวขุ่นเหมือนนมสด นำไป autoclave ที่ อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที

เตรียมสารละลาย Normal saline 0.85 % แบ่งใส่หลอดทดลองหลอดละ 3 ml โดยใช้ serological pipette นำไป autoclave ที่ อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 นาที
เก็บตัวอย่างดอกไม้จากแหล่งต่าง ๆ มาตัดเฉพาะส่วนเกสรดอกไม้ ใส่ใน Normal saline ที่ ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว นำไป Mix ด้วยเครื่อง vortex เพื่อให้มีการกระจายตัวของเชื้ออยู่ในสารละลาย Normal saline

ตัวอย่างดอกไม้จากแหล่งต่าง ๆ

วิธีการ spread plate

เชื้อยีสต์ที่ streak บน plate

ูลักษณะการ budding

ชั่ง malt extract broth 1.5 กรัมละลายในน้ำกลั่น 80 ml ปรับปริมาตรเป็น100 ml แบ่งใส่หลอดทดลองฝาเกลียว หลอดละ 3 ml โดยใช้ serological pipette นำไป autoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เวลา 15 นาที ใช้ลูปเขี่ยเชื้อที่ต้องการทดสอบ โดยเลือกโคโลนีเดี่ยว รวมทั้งเชื้อ control ใส่ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เตรียมได้ นำไปเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 วัน นำเชื้อที่เลี้ยงในหลอดทดลองมาตรวจดูลักษณะการ budding โดยใช้ลูปเขี่ยเชื้อประมาณ 1 ลูป แตะลงบนกระจกสไลด์ ปิดด้วย coverslip แล้วไปส่องใต้กล้อง จุลทรรศน์ กำลังขยาย 400 เท่า บันทึกผลการทดลอง ตรวจดูลักษณะการ budding ทุกวันจนครบ 3 วัน

ชั่ง Sodium citrate dihydrate (C₆H₅Na₃O₇ 2H₂O) 0.193 กรัม ละลายในน้ำกลั่น 80 ml ปรับปริมาตรเป็น 100 ml ปรับ pH เป็น 6.8 ชั่ง Agar 1.5 กรัม ใส่ไปในสารละลายที่ปรับ pH แล้ว นำไปเข้าไมโครเวฟ เพื่อให้ Agar ละลาย แบ่งใส่ขวดแบนขนาด 80 ml ขวดละ 30 ml นำไปautoclave ที่ อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 นาที นำอาหารเลี้ยงเชื้อในขวดแบนมาเอียงเพื่อทำ slant นำเชื้อยีสต์ที่สร้าง clear zone และเชื้อ control ที่ได้เป็นโคโลนีเดี่ยว ๆ มา streak ลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ทำ slant ไว้ ตรวจผลการสร้างสปอร์เมื่อเลี้ยงไว้บน slant เป็น 1, 2, 3, 4, 5, และ 6 สัปดาห์ตามลำดับ

ลักษณะสปอร์ ของเชื้อยีสต์ S. cerevisiae

การย้อมสปอร์

ตรวจสอบ ลักษณะของเชื้อยีสต์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์

โดยการย้อมสปอร์ หยดน้ำกลั่น 1 หยดลงบนแผ่นสไลด์ เขี่ยเชื้อจาก slant แล้ว smear เชื้อให้กระจายและรอให้แห้ง หลังจากนั้นจึง fix ด้วยความร้อน โดยการนำสไลด์ผ่านเปลวไฟ หยด malachite green 0.5 % และ basic fuchsin 0.05 % ให้ท่วมบริเวณที่ smear เชื้อไว้นำสไลด์ที่หยดสีย้อมสปอร์แล้วมาอังเหนือไฟเป็นเวลาประมาณ 1 นาที โดยให้ความร้อนจนกลายเป็นไอ แต่ระวังไม่ให้สารเดือด

ผลการ ferment น้ำตาล สังเกตสีและการสร้างก๊าซ

เตรียม stock indicator โดยชั่ง bromothymol blue 0.05 กรัม ละลายในน้ำกลั่น 75 ml เตรียม basal medium โดยชั่ง yeast extract 0.225 กรัม และ peptone 0.375 กรัม ละลายในน้ำกลั่น 50 ml เติมสาร indicator จาก stock 2 ml ลงใน basal medium แล้วละลายให้เข้ากัน ปรับ pH เป็น 7 แบ่งใส่หลอดทดลองฝาเกลียวขนาด 150? 12 mm หลอดละ 2 ml ใส่หลอดดัก ก๊าซลงไปทุกหลอด นำไปautoclave ที่ อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 นาที เตรียมสารละลายน้ำตาล galactose, glucose, lactose, maltose และsucrose ชนิดละ 6 % กรองสารละลายผ่าน filter sterile โดยใช้กระดาษกรองชนิด nitrocellulose ขนาด 0.45 m แต่ละหลอดทดลอง ใส่สารละลายน้ำตาลปริมาตร 1 ml เขี่ยเชื้อรวมทั้งเชื้อ control ลงบน media ที่เตรียมได้ จ สังเกตการเปลี่ยนแปลง สีของอาหารเลี้ยงเชื้อและการสร้างก๊าซ บันทึกผลการ ทดลองจนครบ 6 สัปดาห์

ผลการทดสอบการใช้
้ไนเตรต

เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ เตรียม YCB 1.17 กรัมและ NaNO₃ 0.5กรัมละลายในน้ำ 3A ปริมาตร 100 ml เตรียม YCB 1.17 กรัม ละลายในน้ำ 3A ปริมาตร 100 ml เตรียม YPD Broth ปริมาตร 100 ml แบ่งอาหารแต่ละชนิด ใส่หลอดทดลอง หลอดละ 5 ml เตรียมน้ำ 3A แบ่งใส่หลอดทดลอง หลอดละ 3 mlนำไปautoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 นาที ใช้ปากกาสีดำ ขนาด 0.7 mm ขีดเป็นเส้นตรง ความยาว 2 เซนติเมตร บนกระดาษสีขาว เขี่ยเชื้อที่สร้าง clear zone และเชื้อ control ลงในน้ำ 3A จนมองเห็นเส้นสีดำจางๆ ชนิดละ 1 หลอด ดูดเชื้อที่ได้ มาลงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี NaNO₃ ไม่มี NaNO₃ และ YPD ชนิดละ100 m l บันทึกผลการทดลองจนครบ 3 วัน

ผลการทดสอบการใช้ inositol

ชั่ง YNB 0.67 กรัม และ inositol 0.5 กรัม ละลายในน้ำ 3A ปริมาตร 100 ml เตรียม YNB 0.67 กรัม ละลายในน้ำ 3A ปริมาตร 100 ml เตรียม YNB 0.67 กรัม และ glucose 1 กรัม ปริมาตร 100 ml แบ่งอาหารแต่ละชนิด ใส่หลอดทดลอง หลอดละ 5 ml เตรียมน้ำ 3A แบ่งใส่หลอดทดลอง หลอดละ 3 ml นำไปautoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 นาที ใช้ปากกาสีดำ ขนาด 0.7 mm ขีดเป็นเส้นตรง ความยาว 2 เซนติเมตร บนกระดาษสีขาว เขี่ยเชื้อที่สร้าง clear zone และ เชื้อ control ลงในน้ำ 3A จนมองเห็นเส้นสีดำจาง ๆ ชนิดละ 1 หลอด ดูดเชื้อที่ได้จากข้อ 3.5.3 มาลงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี inositol ,ไม่มี inositol และ มี glucose 1 % ชนิดละ100 m l บันทึกผลการทดลองจนครบ 3 วัน